Определение роданистого натрия в воде, препарате-дефолианте, биологическом материале (мышцы, паренхиматозные органы, головной мозг, кровь и зерно люпина)
(утв. Минздравом СССР 20.12.1976 № 1534-76)
20 декабря 1976 г. № 1534-76
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОДАНИСТОГО НАТРИЯ В ВОДЕ, ПРЕПАРАТЕ-ДЕФОЛИАНТЕ, БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (МЫШЦЫ, ПАРЕНХИМАТОЗНЫЕ ОРГАНЫ, ГОЛОВНОЙ МОЗГ, КРОВЬ И ЗЕРНО ЛЮПИНА)
Белорусский научно-исследовательский ветеринарный институт им. С.Н. Вышелесского, г. Минск).
Характеристика препарата
Роданистый натрий — высокоэффективный дефолиант люпина. Химически чистый препарат представляет собой белое кристаллическое вещество. Растворяется в воде, ацетоне. Роданистый натрий гигроскопичен.
Принцип метода
Метод основан на экстракции роданид-ионов, бромировании их до бромциана, образовании из бромциана и пиридина глутаконового альдегида и конденсации его с ароматическим амином — бензидином, в результате чего получается красный полимитиловый краситель. Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрически.
Извлечение роданид-ионов из биологического материала основано на водной экстракции и осаждении белков растворами трихлоруксусной кислоты.
Реактивы и растворы
1. Роданистый натрий, химически чистый.
2. Трихлоруксусная кислота 20% и 33% растворы.
3. Бромная вода, насыщенный раствор брома в воде.
4. Ортоарсенит натрия, 1,5% водный раствор.
5. Бензидин, 1% раствор в 0,5 Н соляной кислоте.
6. Пиридин, дважды перегнанный.
7. Серебро азотнокислое, чистое, 1 Н раствор.
8. Кислота азотная, концентрированная.
11. Кислота соляная, концентрированная.
Приготовление стандартного раствора
Из химически чистого роданистого натрия готовят стандартный раствор, содержащий 50 мкг роданид-ионов в 1 мл. Для этого берут 1,396 г роданистого натрия (содержит 1 г роданид-ионов) и растворяют в 200 мл дистиллированной воды, далее 1 мл этого раствора разводят в 100 мл дистиллированной воды (рабочий раствор).
Приготовление бензидинпиридинового реагента
Смешивают 18 мл дважды перегнанного пиридина с 12 мл воды и 3 мл концентрированной соляной кислоты. Затем добавляют 10 мл раствора бензидина и перемешивают до исчезновения мути.
Приборы и посуда
3. Набор пипеток 1, 2, 5, 10 мл.
4. Колбы мерные на 25 мл, колбы на 50, 100, 250 мл.
Описание определения
Построение калибровочной кривой
Калибровочную кривую строят по стандартному раствору. В мерные колбы вносят 0,1; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2 мл стандартного рабочего раствора, доливают до 10 мл водой (колбы на 25 мл).
Затем добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты и по каплям бромную воду до стойкой желтой окраски. Раствор оставляют на 12 минут, периодически помешивая. Затем избыток брома восстанавливают 1,5% раствором ортоарсенита натрия до обесцвечивания раствора и добавляют его избыток 2 — 3 капли. После этого прибавляют 5 мл бензидинпиридинового реагента и через 30 сек. 5 мл ацетона. Раствор доводят до 25 мл и через 15 минут измеряют оптическую плотность на ФЭК при длине волны 530 нм, относительно контроля реактивов, кюветы 3 мм. Окраска устойчива в течение 30 минут.
а) Определение роданид-ионов в воде.
Берут 100 мл исследуемой воды, упаривают при кипячении до 20 мл, из этого количества берут 10 мл. Дальнейший ход методики аналогичен определению роданид-ионов при построении калибровочной кривой. Полученный результат умножают на два.
б) Определение роданид-ионов в препарате-дефолианте.
Точную навеску препарата 1 грамм растворяют в 100 мл дистиллированной воды (маточный раствор). Берут 1 мл маточного раствора, разводят в 100 раз дистиллированной водой и на анализ берут 1 мл этого раствора. Дальнейший ход определения, как при построении калибровочной кривой.
Определение роданид-ионов в биологических средах
Роданид-ионы, как продукт физиологической детоксикации и как один из конечных продуктов белкового обмена, присутствуют в организме здоровых животных. В растительном материале также обнаруживается некоторое количество роданид-ионов. Поэтому, при исследовании биологических сред нужно параллельно определять количество роданид-ионов в контрольной пробе. В качестве контрольной пробы могут быть использованы аналогичные органы и ткани здоровых животных и зерно люпина, не имеющего контакта с роданистыми соединениями. Достоверное превышение показаний исследуемой пробы против контрольной указывает на повышенное содержание роданид-ионов.
а) Определение роданид-ионов в органах и тканях животных.
К 10 г мелкоизмельченного материала добавляют 50 мл дистиллированной воды и шуттелируют в течение часа, затем выдерживают два часа при комнатной температуре. Экстракт фильтруют через слой марли, затем в колбу с исследуемым материалом добавляют еще 50 мл воды и оставляют на 30 минут, периодически встряхивая. Полученный экстракт путем фильтрования через марлевый фильтр объединяют с первым экстрактом. Затем в колбу с экстрактом добавляют 5 мл 33% раствора трихлоруксусной кислоты, смесь нагревают до кипячения и кипятят в течение 1 минуты. После охлаждения экстракт фильтруют через бумажный фильтр, колбу 2 раза ополаскивают дистиллированной водой. Экстракт выпаривают при кипячении до 20 мл. Берут 10 мл экстракта и проводят дальнейшее определение, как при построении калибровочной кривой. Полученный результат умножают на два.
б) Определение роданид-ионов в крови.
В химический стакан наливают 10 мл дистиллированной воды, прибавляют 2 мл крови, перемешивают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем прибавляют 2 мл 33% раствора ТХУ. Смесь нагревают до кипячения и кипятят в течение 1 минуты. После охлаждения экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Стаканчик ополаскивают 5 мл дистиллированной воды. Фильтрат разделяют на две равные части. Берут аликвоту (равную часть) экстракта и проводят дальнейшее исследование, как при построении калибровочной кривой. По калибровочной кривой находят содержание роданид-иона в 1 мл крови.
в) Определение роданид-ионов в зерне люпина.
К 10 г измельченного зерна люпина добавляют 50 мл дистиллированной воды и шуттелируют в течение 1 часа, затем выдерживают в течение 2-х часов при комнатной температуре. Содержимое колбы переносят в центрифужные стаканы, добавляют 5 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют при 4000 об./мин. 20 минут. Надосадочную жидкость сливают в колбу. К осадку добавляют 4 — 5-кратное количество дистиллированной воды, содержимое стакана перемешивают и оставляют на 30 минут, периодически встряхивая. Затем снова центрифугируют при 4000 об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость объединяют с первой порцией. К экстракту добавляют концентрированную азотную кислоту до PH — 1; 3 — 4 капли 1% раствора поваренной соли и по каплям 1 Н раствора азотнокислого серебра до прекращения выделения осадка. Раствор нагревают до кипения и кипятят 2 минуты. После охлаждения осадок отфильтровывают через бумажный фильтр и промывают несколько раз водой и ацетоном, до получения бесцветной промывной жидкости. Фильтр вместе с осадком помещают в стакан и обрабатывают насыщенным раствором сероводорода до перевода всех солей серебра в сульфид серебра (до смыва осадка с фильтра и получения черной окраски). Раствор фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат выпаривают до 20 мл. Берут 10 мл экстракта и проводят дальнейший анализ аналогично построению калибровочной кривой. Полученный результат умножают на два.
Расчет содержания роданистого натрия проводят по формуле:
А
Х — количество роданистого натрия в мг/кг;
А — мкг роданид-ионов, найденных по калибровочной кривой;
Д — навеска образца в граммах;
К — коэффициент перерасчета на исследуемый препарат; для роданистого натрия — 1,396.
Процент извлекаемости препарата
Из воды - 99% +/- 0,08 Из материала животного происхождения - 97% +/- 0,05 Из зерна люпина - 77% +/- 0,09.
Чувствительность определения
В воде - 0,1 мг/л В материале животного происхождения - 0,5 мг/кг В зерне люпина - 0,5 мг/кг.
В биологическом материале роданиды содержатся в норме как продукт физиологической детоксикации и как один из конечных продуктов белкового обмена в пределах:
мышцы - 3 - 5 мг/кг печень - 7 - 10 мг/кг кровь - 0,006 - 0,01 мг/мл в зерне люпина - 0,5 - 0,8 мг/кг.
Присутствие в образцах гербицидов группы 2,4-Д, гексахлорана, хлорофоса не мешает определению роданид-иона.