Ротавирусная инфекция. Методические рекомендации

(утв. Минздравом СССР 07.03.1989 № 15-6/6)

7 марта 1989 г. № 15-6/6

РОТАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ

(МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ)

Основное учреждение-разработчик:

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Учреждения-соисполнители:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии Минздрава СССР;

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Минздрава РСФСР;

Научно-производственное объединение «Ростэпидкомплекс»;

Всесоюзный научно-исследовательский институт дезинфекции и стерилизации Минздрава СССР.

Методические рекомендации предназначаются для практических и научных работников органов и учреждений здравоохранения.

1. Этиология

Ротавирус человека относится к группе сходных между собой вирусов животных, которая, кроме него, включает вирус диареи телят Небраски (NCDV), вирус эпизоотической диареи молодых мышей (EDJM), вирус обезьян (SA-II), вирус, происходящий из кишечного содержимого овец и крупного рогатого скота (0), а также — возбудители диареи поросят, жеребят, щенят и других животных. Все эти вирусы имеют одинаковые размеры и форму и близки друг к другу в антигенном отношении.

Ротавирусы животных хорошо размножаются в культуре ткани, поэтому были выделены и изучены раньше, чем ротавирус человека. Ротавирусы телят и обезьян, благодаря их антигенной близости к ротавирусу человека, были использованы для установления его этиологической роли при острых гастроэнтеритах и употребляются до настоящего времени в их серологической диагностике и для получения иммунореагентов.

    Ротавирус  человека  был обнаружен при помощи электронной микроскопии в
клетках  эпителия  двенадцатиперстной кишки и в экстрактах фекалий типичных
больных,  где он нередко содержится в весьма значительных концентрациях (до

11

10    частиц  в  1,0  г  фекалий).  Вирион  ротавируса  представляет  собой
двухкапсидную  (т.е.  покрытую  двухслойным  белковым  чехлом)  сферическую
частицу  диаметром  70  - 75 нм, содержит рибонуклеиновую кислоту - РНК (11
двухнитевых  сегментов),  имеет  плавучую  плотность в хлористом цезии 1,36

г/куб. см с коэффициентом седиментации 500 — 530 S.

По имеющимся характеристикам ротавирус человека вместе с перечисленными выше вирусами животных был отнесен к роду Rotavirus семейства Reoviridae. Название «ротавирус» происходит от латинского rota — колесо, которое частица вируса напоминает в электронно-микроскопических препаратах.

По антигенной специфичности, обнаруживаемой с помощью иммуноферментного анализа, ротавирусы разделяются на две подгруппы (обозначаются римскими цифрами — I и II), а по специфичности, выявляемой в реакции нейтрализации, — на 4 (а возможно и более) серотипа (обозначаются арабскими цифрами — 1, 2, 3, 4). Подгрупповая специфичность тех или иных ротавирусов определяется основным белком внутреннего капсида, а их серотипическая специфичность — гликопротеидом внешнего капсида. Недавно обнаружены ротавирусы нового типа (т.н. параротавирусы), которые не имеют группоспецифического антигена.

2. Эпидемиология

Ротавирусная инфекция имеет повсеместное распространение. Сведения о ее выявлении опубликованы в Австралии, Великобритании, ГДР, Канаде, Индии, Испании, США, Франции, Японии и многих других странах. В Советском Союзе заболевания ротавирусным гастроэнтеритом зарегистрированы среди детей и взрослых ряда областей РСФСР, Закавказья, Украины, Прибалтики, Средней Азии и других территорий. Среди детей и взрослых ротавирусная инфекция может проявляться в виде спорадических случаев, локальных групповых заболеваний и массовых вспышек с охватом на обширных территориях различных групп населения. Среди госпитализированных больных острыми кишечными инфекциями удельный вес взрослых с ротавирусным гастроэнтеритом в среднем составляет 10 — 15%, детей — 15 — 27% и более. Данные литературы о выделении ротавируса (антигена) здоровыми детьми и взрослыми весьма противоречивы: от 0 — 0,5 до 42% — у детей и от 0% до 7% и более — у взрослых. Ротавирусная инфекция регистрируется в течение всего года. Однако свыше 70% больных выявляется в холодное время года. В зимне-весеннем периоде регистрируется также большинство вспышек ротавирусной инфекции среди населения, а также групповые заболевания среди новорожденных и недоношенных детей, детей организованных коллективов, престарелых лиц. Выраженных различий в распределении заболевших ротавирусной инфекцией (как детей, так и взрослых) по полу выявить не удалось.

Источником инфекции при ОКИ ротавирусной этиологии являются инфицированные взрослые и дети — больные манифестной формой инфекции или бессимптомно выделяющие ротавирусы с фекалиями. При этом дети первого года жизни часто заражаются от инфицированных ротавирусами матерей, а дети более старшего возраста и взрослые — от детей организованных детских коллективов. Заражение человека от животных не доказано, хотя возможность его не исключается. В настоящее время ротавирусы разных серотипов обнаружены в экскретах почти 50 видов животных и птиц с выраженными признаками диареи и без таковых.

    Ротавирусы  у  больных  и  лиц без клинических проявлений заболевания в
настоящее  время  обнаружены  только в фекалиях. В окружающую среду больные

выделяют ротавирусы, начиная с первого дня болезни, при этом у всех больных

                                                         10     11
максимальное  количество  возбудителя  в  фекалиях (до 10   - 10   вирусных
частиц  в 1 г) выявлено в течение первых пяти дней болезни, что  определяет
наибольшую  эпидемиологическую  опасность  больных  для окружающих именно в
этот   период  болезни.  В  течение  последующих  6  -  10  дней  выделение
ротавирусов  с  фекалиями  больных резко падает по мере нормализации стула.
Средняя  продолжительность  выделения ротавирусов больными  составляет  7 -
8  дней,  но у отдельных больных  этот период может продолжаться до 20 - 30
дней. Лица без  клинических проявлений заболевания могут длительно выделять

ротавирусы с фекалиями — до нескольких месяцев и более (период наблюдения).

Основной механизм передачи ротавирусов — фекально-оральный, реализуемый водным, пищевым и бытовым путями передачи. При спорадических и локальных групповых заболеваниях инфицирование ротавирусами происходит преимущественно бытовым путем. Этому способствует очень низкая патогенная доза ротавирусов (в пределах 10 вирусных частиц). Установлено, что на различных объектах внешней среды ротавирусы сохраняют жизнеспособность от 10 — 15 дней (в зависимости от температуры и влажности воздуха) до одного месяца; в фекалиях — от нескольких недель до семи месяцев.

В настоящее время в нашей стране и за рубежом регистрируются водные и пищевые вспышки ротавирусной инфекции. Ротавирусы обнаруживаются в воде рек, озер, морей, в подземных водах, водопроводной воде, отдельных пищевых продуктах (молоко и др.).

Возможность реализации в отдельных случаях капельного, пылевого и других путей распространения ротавирусов носит предположительный характер.

Ротавирусы известны также как один из главных этиологических агентов при нозокоминальных (внутрибольничных) вспышках острого гастроэнтерита. В условиях стационаров разного профиля могут инфицироваться до 50 — 60% больных детей. Известны случаи вспышек в родильных домах. Чаще поражаются дети, находящиеся на искусственном вскармливании, страдающие острыми и хроническими заболеваниями, с различными видами иммунодефицита.

Восприимчивость иммунитет. К ротавирусам восприимчивы люди всех возрастных групп. При этом наибольшая восприимчивость отмечается у детей в возрасте от 6 мес. до 2-х лет. Антитела к ротавирусам выявляются у 50 — 60% детей первого года жизни, в возрасте старше 3-х лет — уже более чем у 90% и практически у всех взрослых. Однако, согласно данным литературы, наличие антител в сыворотке крови свидетельствует в основном лишь о встрече организма человека с ротавирусом, а не о наличии иммунитета, так как даже при значительном уровне гуморальных антител возможны повторные заболевания. Иммунитет при ротавирусной инфекции окончательно не изучен. Считается, что резистентность к инфекции обусловлена в основном местной невосприимчивостью клеток эпителия тонкого кишечника, связанной с наличием секреторных антител класса IgA. Указанные антитела содержатся также в молоке кормящей матери и, видимо, служат фактором пассивной иммунизации новорожденных детей, которые при отсутствии клинических проявлений болезни с фекалиями могут выделять значительные количества ротавирусов в окружающую среду и заражать недоношенных детей и детей с неблагоприятным преморбидным фоном. Ротавирусы различных серотипов не создают перекрестного иммунитета, в связи с чем у одного и того же ребенка или взрослого возможны повторные заболевания, обусловленные другими серотипами вируса. Отмечается также нестойкий характер иммунитета у переболевших ротавирусным гастроэнтеритом, повторные заболевания нередко регистрируются через 1 — 1,5 года после перенесенной инфекции.

Особенности эпидемического процесса при ротавирусной инфекции:

• повсеместность территориального распространения;
• выраженная зимняя или зимне-весенняя сезонность;
• низкая заражающая доза возбудителя и высокая очаговость в организованных коллективах;
• поражение лиц всех возрастных групп;
• высокий удельный вес заболевших среди детей до 2-х лет с максимумом выявления заболеваний среди детей второго полугодия жизни;
• высокая активность водного и бытового путей передачи инфекции;
• локальность домашних очагов, ограниченных преимущественно семьей;
• возможность бессимптомного выделения ротавирусов среди детей и взрослых;
• возможность внутрибольничного распространения инфекции при участии медицинского персонала и родителей больных детей.

3. Клиника

Клиническая картина ротавирусной инфекции имеет много общего с клиническими проявлениями острых кишечных заболеваний другой этиологии, что затрудняет диагностику этого заболевания. Однако существует ряд характерных отличий, позволяющих своевременно заподозрить это заболевание и правильно проводить противоэпидемические и лечебные мероприятия.

Инкубационный период короткий и длится от 15 часов до 3 — 5 суток, но чаще всего — 1 - 3 дня.

    У  большинства больных отмечается острое начало заболевания, когда весь
симптомокомплекс  развивается  в  первые  сутки  болезни.  У  детей раннего
возраста  возможно  подострое начало, характеризующееся появлением в первые
дни  болезни  1  или  2-х симптомов и присоединением остальных со 2 - 3 дня
болезни.   Наиболее  патогномоничным  для  ротавирусной  инфекции  является

поражение желудочно-кишечного тракта, которое у 60 — 70% больных сочетается

с  развитием  симптомов поражения респираторного тракта. Иногда катаральные
явления   могут   предшествовать   на  3  -  4  дня  дисфункции  кишечника.
Респираторный  синдром  характеризуется умеренной гиперемией и зернистостью
зева,  мягкого  неба  и  небных  дужек, заложенностью  носа, покашливанием,
которые  в отличие от ОРВИ  менее выражены, не имеют тенденции к нарастанию
и  кратковременны  (4  - 5 дней). Диарея отмечается у 95 - 97% больных. Для
ротавирусной  инфекции  характерно  развитие гастроэнтерита, реже энтерита.
Стул  обычно  жидкий,  водянистый, пенистый, слабо окрашенный, без примесей
или  с  небольшой  примесью  слизи.  У  детей  раннего возраста преобладает
водянистая  диарея, чем и объясняется более частое развитие эксикоза в этой
возрастной  группе. Частота стула в среднем не превышает 4 - 5 раз в сутки,
но  может  достигать  у  детей  младшего возраста 15 - 20 раз. Длительность
диареи  у  взрослых  и  детей  старшего  возраста  составляет 3 - 7 дней, у
грудных  детей  нередко  продолжается  до  10  -  14  дней.  Рвота является
кардинальным  симптомом  и отмечается у 80% больных ротавирусной инфекцией.

Чаще всего она возникает одновременно с поносом или предшествует ему. Рвота

нередко   повторная,  но  кратковременная  (1  -  2  дня).  Многократная  и
неукротимая  рвота для данной инфекции не характерна и чаще свидетельствует

о смешанной инфекции. Температура, как правило, не превышает 38,5 — 39 °C и

нормализуется  к  3  -  4  дню болезни. Наиболее типичными признаками общей
интоксикации   являются   слабость,   вялость,   адинамия,  головная  боль,
головокружение.  Тяжесть  заболевания определяется развитием изотонического

эксикоза I — II степени, реже III степени, который чаще встречается у детей + + грудного возраста. При этом потери электролитов (Na и K ) невелики, что надо учитывать при проведении регидратационной терапии.

4. Диагностика и дифференциальная диагностика

При объективном обследовании у больных отмечается вялость, гиперемия конъюнктив и инъекция сосудов склер. Язык умеренно обложен, суховат. Живот мягкий, умеренно болезненный при пальпации в области расположения тонкого кишечника. Печень и селезенка не увеличены. Слепая и сигмовидная кишки мягкие, безболезненные. Артериальное давление снижено. Пульс не учащен, а скорее имеется склонность к относительной брадикардии. Менингеальных явлений нет. В периферической крови в самом начале болезни может иметь место умеренный лейкоцитоз, со 2 — 3 дня болезни имеет место склонность к лейкопении со снижением числа палочкоядерных форм лейкоцитов и ростом числа лимфоцитов и моноцитов, СОЭ не ускорена.

При лабораторном анализе мочи отмечается небольшая альбуминурия, быстро проходящая микрогематурия, небольшое повышение числа лейкоцитов и возможно появление гиалиновых цилиндров. Изменения в моче находятся в соответствии со степенью тяжести течения болезни и обезвоживания.

При микроскопическом исследовании кала число лейкоцитов не превышает 10 — 15 в поле зрения, отмечается примесь слизи.

Ректороманоскопически можно выявить умеренную гиперемию слизистой оболочки прямой и сигмовидной кишок без очаговых изменений.

Ротавирусный гастроэнтерит подразделяют по степени тяжести, которая определяется интенсивностью диареи и обусловленного ею обезвоживания организма, а также выраженностью общей интоксикации. Различают три степени тяжести течения ротавирусного гастроэнтерита: легкая, средне-тяжелая и реже тяжелая.

Дифференциальная диагностика проводится с сальмонеллезом, холерой, дизентерией, пищевыми токсикоинфекциями, вызванными условно патогенными микроорганизмами, персиниозом, другими вирусными гастроэнтеритами.

Для гастроинтестинальной формы сальмонеллеза характерно одновременное заболевание лиц, употреблявших в пищу недоброкачественные продукты. Типично острое начало: гипертермия, сильный озноб, рвота, сильная боль в животе, профузный зловонный стул, сохраняющий каловый характер, нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы влево. При сальмонеллезе отсутствуют изменения слизистой оболочки зева, печень обычно увеличена. Выделение возбудителя при бактериологическом исследовании испражнений, рвотных масс или промывных вод желудка решает вопрос о диагнозе.

По многим клиническим признакам массовости и быстроте распространения заболеваний ротавирусный гастроэнтерит может напомнить холеру. Но ротавирусная инфекция отличается более легким течением и в частности тем, что при ней не развивается состояние алгида, а также наличием типичных изменений слизистой оболочки ротоглотки.

Важнейшее значение приобретают результаты бактериологического исследования в случае обнаружения холерных вибрионов. Аналогичное положение имеет место и при НАГ-инфекции.

Бактериальная дизентерия отличается острой болью в животе, частыми, иногда ложными, позывами, стулом с примесью слизи и крови, выраженным сигмоидитом, постоянной лихорадочной реакцией, патологическими изменениями в дистальном отрезке толстой кишки по данным ректоскопии. Все эти признаки, а также результаты бактериологического исследования позволяют сравнительно легко провести дифференциальную диагностику при колитической форме дизентерии. При гастроэнтерической форме дизентерии значение результатов бактериологического исследования резко возрастает.

Дифференциальная диагностика ротавирусного гастроэнтерита и пищевых токсикоинфекций, вызываемых условно патогенными возбудителями, особенно сложна, если учесть недостаточную изученность клинической картины этих заболеваний. По диагностической значимости из лабораторных исследований следует отдавать предпочтение положительным результатам вирусологических и иммунологических исследований, подтверждающих ротавирусную природу заболевания, а не обнаружению условно патогенных бактерий в испражнениях больного.

Для гастроинтестинальной формы персиниоза характерно более постепенное начало, наличие, наряду с гастроэнтеритом, болей в мышцах, суставах; печень, как правило, увеличена; стул вязкий из-за значительной примеси слизи, а иногда возможна примесь крови. В крови отмечается лейкоцитоз; СОЭ повышена.

Синдром гастроэнтерита может занимать видное место при некоторых вирусных заболеваниях. К их числу относится аденовирусная инфекция, для которой, помимо поражения кишечника, характерным является конъюнктивит, ринит, фарингит, тонзилит, бронхит, пневмония, увеличение шейных лимфатических узлов, печени, селезенки, длительная лихорадка.

От энтеритов и гастроэнтеритов, вызванных энтеровирусами Коксаки и ЕСНО, ротавирусный гастроэнтерит отличается моносиндромной клинической картиной, в которой ведущее место занимает поражение кишечника. В противоположность этому при эпидемических вспышках энтеровирусной природы отмечается наличие различных клинических форм болезни, «многоформность» клинической картины, в которой существенное место могут занимать симптомы поражения оболочек головного мозга, кожи, верхних дыхательных путей.

Дифференциальная диагностика ротавирусной инфекции с эшерихиозами у детей наиболее трудна и может основываться на следующих критериях:

• большая острота начала ротавирусной инфекции по сравнению с эшерихиозами, особенно обусловленных энтеропатогенными эшерихиями;
• более быстрое выздоровление при ротавирусной инфекции, даже у детей раннего возраста;
• большая частота респираторного синдрома при ротавирусной инфекции, но его меньшая выраженность и продолжительность.

Наибольшие сложности представляет диагностика смешанных ротавируснобактериальных инфекций, удельный вес которых в зимние сезоны года довольно велик (7 — 10% от всех ОКИ).

Особенностью клиники смешанных инфекций является наличие симптомокомплексов, свойственных обеим сочетающимся инфекциям: нарастание симптомов интоксикации, появление признаков воспалительных изменений слизистой тонкой и толстой кишки, замедление сроков выздоровления.

5. Лечение

Госпитализация детей и взрослых с подозрением на ОКИ, вызванные ротавирусами, проводится по клиническим (тяжесть заболевания) и эпидемиологическим показаниям (наличие в окружении заболевшего ослабленных детей, детей первого года жизни, посещающих дошкольные детские учреждения, работников пищевых предприятий и лиц, приравненных к ним, невозможность соблюдения противоэпидемического режима на дому и др.). Дети в возрасте до года с выраженной симптоматикой ОКИ госпитализируются в первую очередь. Обязательна раздельная госпитализация больных с подозрением на ротавирусный гастроэнтерит и ОКИ иной этиологии (отдельные палаты, боксы). Необходимо соблюдать принцип «одномоментного заполнения» палат (боксов).

Лечение больных с ротавирусным гастроэнтеритом, с учетом существующих представлений о патогенезе этого заболевания, включает в себя щадящий режим и компенсацию нарушений функционального состояния кишечника, восстановление гидроэлектролитного баланса и детоксикации организма.

На время острого периода болезни назначается диета 4-Б, при которой имеет место резкое ограничение углеводов (до 200 г) и увеличение количества белка (до 150 г) с некоторым снижением калорийности (2400 кал.). Ограничивается количество сахара до 40 г в день, овощей и фруктов. Исключается молоко. Соль не ограничивается.

Показано назначение таких пищеварительных полиферментных препаратов отечественного производства как ораза, солизим, сомилаза, которые в терапии больных ротавирусным гастроэнтеритом не уступают импортным (панзинорм, дигестал, фестал, трифермент и прочие).

Обязательно оценивается степень дегидратации организма и проводится терапия, направленная на восполнение избыточных потерь воды и солей. При обезвоживании I — II степени по В.И. Покровскому назначаются глюкозо-электролитные растворы орально (регидрон глюкосолан) с учетом потерь жидкостей и электролитов, а при обезвоживании III степени необходимо начинать лечение с внутривенного введения водно-солевых растворов (трисоль, квартесоль, хлосоль, ацесоль) и др.

Тактика введения растворов проводится в соответствии с принципами регидратационной терапии.

С целью стабилизации нормальных показателей кровообращения и дезинтоксикации можно вводить коллоидные растворы (гемодез, полиглюкин, реополиглюкин).

Необходимо подчеркнуть, что назначение антибактериальных препаратов, если нет сопутствующей бактериальной инфекции, не обосновано.

Целесообразно применение адсорбирующих и вяжущих препаратов.

Лечение вирусоносительства в настоящее время не разработано.

Выписка реконвалесцентов проводится после стабильной (в течение 2 — 3 дней) нормализации стула и исчезновения всех других клинических симптомов основного заболевания при отсутствии осложнений.

Детям, посещающим дошкольные учреждения, работникам пищевых объектов и лицам, к ним приравненных, проводится однократное вирусологическое обследование по исчезновении клинических симптомов.

Остальные контингенты больных не подлежат обязательному лабораторному обследованию.

6. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика ротавирусного гастроэнтерита в настоящее время не представляет трудности. Быстрое развитие клинического синдрома и краткосрочное пребывание больного в стационаре диктуют необходимость применения экспресс-методов установления этиологии заболевания. Большинство методов лабораторной диагностики, рекомендуемых в настоящем руководстве, позволяют выявить ротавирусы в течение первых суток. Выбор метода в каждом случае определяется технической оснащенностью лаборатории, а также наличием соответствующих реагентов.

Традиционные методы обнаружения серологических сдвигов в сыворотках больных (реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации и связывания комплемента) имеют значение при ретроспективном анализе заболевания. Поэтому для ранней серологической диагностики ротавирусной инфекции рекомендуется определение антител класса IgM.

Объектом вирусологического исследования больного человека служат обычно фекалии. Наличие и распространение ротавирусов в окружающей среде выявляются путем исследования образцов почвы, пищевых продуктов и воды (сточные воды, вода естественных и искусственных водоемов, питьевая вода).

6.1 Обнаружение ротавирусов в клиническом материале

и в образцах окружающей среды

6.1.1 Подготовка образцов для исследования; отбор проб

При отборе проб для вирусологического исследования соблюдают некоторые общие требования, принимая меры предохранения материала от контаминации. Пробы отбирают только в стерильную посуду с плотной резиновой пробкой, укрепленной лейкопластырем. Транспортируют пробы в контейнерах со льдом или хладоагентом.

6.1.2 Приготовление суспензий, осветление,

очистка образцов, удаление бактериальной флоры

Подготовка образцов фекалий к исследованию на ротавирус включает приготовление 10% суспензии, гомогенизацию, центрифугирование при 3000 об./мин. в течение 30 минут для удаления бактериальной флоры. При обследовании объектов внешней среды и пищевых продуктов проводят предварительное концентрирование исследуемого материала.

6.1.3 Концентрирование вирусных частиц в образцах воды

Концентрирование ротавирусов — важное условие повышения эффективности их обнаружения в водных объектах окружающей среды.

Метод концентрирования ротавирусов с помощью адсорбционной хроматографии на пористом кремнеземе — макропористом стекле (МПС) — прост и удобен, при использовании объемов воды от 0,1 до 10 л. При пропускании образца через слой МПС, вирус сорбируется на поверхности стекла. Для элюции вируса используют растворы, обладающие способностью вызывать десорбцию вируса. Вирус снимается со стекла небольшим объемом раствора, что приводит к концентрированию в десятки — сотни раз по сравнению с исходной пробой.

    Для  повышения  адсорбционных  свойств  отечественные  препараты стекла
марки  МПС-1000  ВГХ обрабатывают следующим образом: готовят смесь (1:1) 3%
H O   и  6 М HCl. Стекло заливают  приготовленной смесью из расчета 1 объем

2 2 стекла на 2 объема смеси. Кипятят в вытяжном шкафу (без пробки) в течение 1 часа, соблюдая меры предосторожности. Отмывают до нейтрального pH дистиллированной водой. Высушивают при температуре 100 °C.

    Стеклянную колонку, предварительно  обработанную силиконовой жидкостью,
заполняют  стеклом  (2  - 3 куб. см), замоченным в дистиллированной воде. К
исследуемой   пробе   (3  л)  добавляют  1  М  раствор  MgCl   до  конечной

                                                        2

концентрации  0,05  М. Воду пропускают через колонку со скоростью 150 - 500
мл/час,  регулируя  скорость протекания с помощью зажимов. Пропускают через
колонку  10  мл  элюирующего  раствора:  мясной  экстракт  3%,  pH 9,0; или
триптозофосфатный  бульон  1%,  pH  9,0; или трис HCl 0,1 М, содержащий 2 М
NaCl,  pH  11,0  (растворы  перечислены  в  порядке  снижения их элюирующих
свойств).  Сорбируют  фракции  объемом  1  мл,  pH  во  фракциях доводят до

нейтрального значения.

6.2 Обнаружение вирусных частиц с помощью электронной

микроскопии (ЭМ) и иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ)

Так как в первые 2 — 3 дня болезни содержание частиц ротавируса в фекалиях типичных больных обычно велико, то для выявления ротавируса достаточно широко применяется метод ЭМ, с помощью которого можно обнаружить ротавирусные частицы без дополнительного концентрирования фекальной суспензии.

Для приготовления препаратов каплю исследуемой 10% суспензии наносят на пластинку зубного воска или парафинированную бумагу. На каплю пленкой-подложкой вниз накладывают предметную электронно-микроскопическую сетку. Спустя 1 — 3 мин. сетку промывают на капле дистиллированной воды и контрастирующего раствора (2% раствор фосфорновольфрамовой кислоты, доведенной до pH 6,5 — 6,6 с помощью 1 NKOH), избыток которого через 30 — 40 сек. удаляют фильтровальной бумагой и сетку высушивают. Просмотр препаратов проводят в электронном микроскопе при инструментальном увеличении 30 — 50000x.

Ротавирусы достаточно легко выявляются при ЭМ исследовании фекальных суспензий по характерным размерам и морфологии вирусных частиц. Ротавирусы следует дифференцировать от различных вирусных частиц и вирусоподобных образований, частиц бактериофагов и бактериальных жгутиков, встречающихся в фекальном материале.

Применение техники ИЭМ дает возможность в ряде случаев не только повысить процент обнаружения ротавирусов, но и доказать их этиологическую роль. Для исследования методом ИЭМ 0,1 мл разведенной 1:5 иммунной сыворотки животных смешивают с 0,4 мл 10% экстракта фекалий. Смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в течение 12 часов при 4 °C, после чего центрифугируют в течение 90 мин. при 15000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают, а полученный осадок ресуспендируют в нескольких каплях дистиллированной воды, контрастируют 2% раствором фосфорновольфрамовой кислоты (pH 6,5) и помещают на предметные сетки; избыток влаги удаляют фильтровальной бумагой. Изучение препаратов проводят в электронном микроскопе при инструментальном увеличении 50000x, просматривая не менее пяти ячеек предметной сетки. В случае положительного результата ротавирусные частицы выявляются в препаратах в виде специфических скоплений (иммунных комплексов).

6.3 Выявление антигена ротавируса в исследуемом материале

6.3.1 Получение иммунореагентов

Гипериммунные сыворотки и специфические иммуноглобулины к ротавирусу получают путем иммунизации кроликов, морских свинок, кур.

Антиген для иммунизации получают следующим образом: 5 мл культуральной суспензии ротавируса SA-II обрабатывают трипсином, вносят в матрацные колбы емкостью 1,5 литра с монослоем гетероплоидных клеток почки зеленой обезьяны

4647,  инкубируют  в  течение 60 минут при 37 °C; добавляют бессывороточную
поддерживающую  среду  и выдерживают в течение 24 - 48 часов при 37 °C. Всю
биомассу  подвергают 3-кратному  замораживанию  или обработке ультразвуком,
добавляют  ПЭГ М 6000 до 8 - 10% концентрации, оставляют 20 часов при 4 °C,

затем центрифугируют при 10000 об./мин. 2 часа. Осадок ресуспендируют в ФСБ

(1/30  -  1/50  от объема биомассы). После очистки фреоном 113, водную фазу
используют   для   иммунизации   животных   и   в   качестве  антигена  при
иммунологических  исследованиях. Концентрат в объеме 1 мл содержит не менее

10 10 вирусных частиц.

Иммунизация кроликов: кроликам вводят внутривенно по 2 мл препарата ротавируса в 1, 7, 35, 42 дни, забор крови на 49 день после начала иммунизации. В 1 и 35 дни вводят антиген дополнительно с полным адъювантом Фрейнда в несколько точек спины.

Фракцию иммуноглобулинов осаждают из гипериммунной сыворотки кролика 10% водным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Осадок собирают центрифугированием, растворяют и диализуют против 0,01 М К-фосфатного буфера (pH — 7,4) с 0:01 М Nace (ФСБ). Концентрацию иммуноглобулинов определяют спектрофотометрически.

Иммунизация морских свинок: животным вводят внутримышечно 0,5 мл концентрированного препарата ротавируса с равным объемом полного адъюванта Фрейнда в 1,14 и 28-ой день, забор крови через две недели после последней иммунизации.

Иммунизация кур: 20-недельных кур несушек гибридов породы белый лекгорн «Заря-17» иммунизируют внутривенно в 1, 14, 28 дни. При первой иммунизации антиген вводят дополнительно внутримышечно в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Максимальное количество антител в желтке наблюдают после третьей иммунизации. Куры могут быть использованы перманентно после реиммунизации.

Выделение иммуноглобулинов кур: желток отделяют от белка в скорлупе или воронке Бюхнера и отмывают водопроводной водой. Желток (10 мл) переносят в центрифужную пробирку, добавляют двойной объем (20 мл) ФСБ и тщательно перемешивают. Вносят ПЭГ 6000 до концентрации 3,5% (вес/объем) и перемешивают 10 мин. при 14000 g. Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр. Вносят дополнительно ПЭГ 6000 до конечной концентрации 12% и перемешивают. Выпавшие в осадок иммуноглобулины собирают центрифугированием (10 мин. 14000). Осадок растворяют в 5 мл ФСБ (1/2 объема желтка). Концентрация белка в препарате обычно составляет 6 — 12 мг/мл.

6.3.2 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на применении антител, меченных молекулой фермента (пероксидазой), является одним из наиболее распространенных и эффективных и специфических методов детекции вирусного антигена. Обычно используют прямой и непрямой «сэндвич» — варианты. Фермент-маркер выявляют в цветной реакции с субстратом. Прямой вариант ИФА быстрее, чем непрямой, однако он менее чувствителен и специфичен. При постановке непрямого варианта используют антивидовой коммерческий конъюгат иммуноглобулинов с ферментом; для предотвращения неспецифического взаимодействия между конъюгатом и сорбированными на панели антителами необходимо иметь антивирусные сыворотки двух различных видов животных.

Непрямой вариант ИФА: в лунки вносят по 0,1 мл антиротавирусные иммуноглобулины из желтка яиц иммунизированных кур в половину (48) лунок. В другую половину вносят в качестве отрицательного контроля иммуноглобулины из яиц, снесенных до иммунизации. Сорбцию иммуноглобулинов проводят из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при 4 °C. Содержимое лунок сливают, лунки промывают ФСБ-Т и вносят по 0,1 мл исследуемого образца в ФСБ-Т с 1% БСА и 0,01 М ЭДТА в лунки с антиротавирусными и нормальными иммуноглобулинами и инкубируют 1 час при 37 °C.

    После  отмывания  в  лунки  вносят по 0,1 мл антиротавирусной сыворотки
кролика, разведенной  до  1:1000  -  1:25000  в  буфере  ФСБ-Т. Оптимальное
разведение  сыворотки  определяют  в  предварительно  поставленных  опытах.

Панели закрывают и инкубируют 2 часа при 37 °C. Лунки промывают и вносят по

0,1  мл  коммерческого  препарата меченных пероксидазой антител против  IgG
кролика  в  концентрации  1  -  2,5  мкг/мл  по  содержанию  пероксидазы  в
ФСББ-Т-БСА  и инкубируют 1 час при 37 °C. Лунки промывают, вносят по 0,1 мл
свежеприготовленной  субстратной смеси (О-фенилен-диамин 0,5 мг/мл в 0,05 М
Na-цитратном  буфере  pH  5,0;  H O   -  0,03%.  (Внимание!  Работа требует

                             2 2

осторожности!)) и  инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение
30  -  40 мин. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 3 М
H SO .  Результаты  реакции  учитывают визуально или спектрофотометрически.
 2  4
Положительными  считают пробы, оптическая плотность которых не менее, чем в

2 раза превышает оптическую плотность отрицательного контроля.

6.3.3 Метод коагглютинации

Этот метод основан на способности белка A золотистого стафилококка штамма Cowan соединяться с Fc — фрагментом IgG, и при образовании специфического комплекса антиген-антитело вызывать феномен агглютинации.

Для постановки реакции коагглютинации используют коммерческий сухой стафилококковый реагент, содержащий белок A (НИИЭМ им. Пастера, Ленинград), который регидратируют перед использованием в 0,1% растворе метиленового синего.

Предварительно, каждую серию гипериммунной сыворотки проверяют на наличие антистафилококковых антител. Для этого на предметном стекле смешивают равные объемы сыворотки в разведении 1:500 и 10% суспензию стафилококка. Учитывают результаты в течение 5 минут по образованию агглютината. Для работы отбирают сыворотки, которые не содержат антистафилококковых антител в разведении 1:500. Для приготовления диагностикума 0,01 мл антиротавирусной сыворотки, разведенной 1:10 ФСБ смешивают с 0,5 мл 10% взвеси стафилококка, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляют 9,5 мл ФСБ (диагностикум). Таким же образом сенсибилизируют стафилококк преиммунной сывороткой (контрольный реагент). Диагностикум и контрольный реагент используют в реакции РКА и ТРКА.

Для постановки РКА в u-образные лунки панели вносят 0,05 мл ФСБ pH-7,4; в две лунки вносят микротитратором Такаччи или дозатором 0,05 мл 10% суспензии фекалий и готовят серийные двухкратные разведения 1:2 — 1:256. В лунки первого ряда добавляют по 0,05 мл диагностикума, а в лунки второго ряда по 0,05 мл контрольного реагента. Панели накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 °C — 3 часа. В каждом опыте испытываются ранее установленные путем электронной микроскопии положительная и отрицательная на ротавирус проба суспензии фекалий, а также лизаты клеток инфицированных ротавирусом SA-II.

Учет реакции: положительными считают результаты, когда в ряду с диагностикумом выявляется агглютинационный «зонтик», при отрицательном результате или снижении титра в 4 раза в параллельном ряду с контрольным реагентом. Отрицательными считают результаты, когда в обоих параллельных рядах образуются диски. В целях устранения неспецифической коагглютинации в парных рядах суспензию фекалий адсорбируют с равным объемом нормальной сыворотки кролика при 37 °C в течение 2-х часов, с последующим прогреванием при 80 °C в течение 45 минут. Затем повторно испытывают в реакции коагглютинации.

6.3.4 Метод твердофазной реакции коагглютинации (ТРКА)

Данный метод выявления ротавирусных антигенов базируется на принципах твердофазного иммуноферментного метода (см. 4.3.2). Однако в отличие от последнего в ТРКА в качестве метки используется не фермент, а диагностикум и контрольный реагент (см. 4.3.3).

Для постановки ТРКА используют иммунологические панели с u-образным дном лунок. Для сенсибилизации в лунки вносят по 0,1 мл гипериммунной сыворотки, разведенной 0,01 М карбонатно-бикарбонатным буфером (pH 9,6) 1:1000. Панели с сыворотками оставляют на 2 — 3 часа при 37 °C. Несвязавшиеся с твердой фазой антитела удаляют трехкратным отмыванием по 3 мин. ФСБТ. После этого в лунки вносят по 0,05 мл исследуемых, а также заведомо положительных и отрицательных проб (по 2 лунки для каждой пробы) и оставляют на 2 часа при 37 °C для образования комплексов антиген-антитело. Несвязавшийся антиген и сопутствующие примеси удаляют трехкратным отмыванием ФСБТ. Затем в одну лунку добавляют 0,05 мл 0,5% стафилококкового диагностикума, во вторую (контрольную) 0,05 мл 0,5% взвеси стафилококка, сенсибилизированного преиммунной сывороткой (см. 4.4.3). Инкубацию проводят либо в течение 1 — 2 часов при 37 °C с последующим помещением на 1 — 3 часа при 4 °C, либо в течение 18 — 24 часов при 4 °C. Результат реакции агглютинации учитывают визуально: при положительной реакции — агглютинированные бактерии образуют «зонтик»; при отрицательной реакции — бактерии полностью оседают в виде диска.

6.3.5 Метод непрямой гемагглютинации

При этом методе выявление антигена ротавируса основано на использовании антительного эритроцитарного диагностикума, представляющего собой эритроциты барана, сенсибилизированные иммуноглобулином асцитной жидкости белых крыс, иммунизированных ротавирусом SA-II.

Двухкратные разведения 10% фекальной суспензии в лунках панели испытывают с эритроцитарным диагностикумом. Агглютинация эритроцитов диагностикума свидетельствует о наличии антигена ротавируса в пробе. Подробное описание методики постановки РНГА изложено в инструкции, прилагаемой к комплекту препарата (Научно-производственное объединение «Ростэпидкомплекс» г. Ростов-на-Дону).

Комплект «Ротатест» основан на обратной пассивной гемагглютинации и предназначен для выявления ротавируса в faeces и для определения антител против ротавируса в сыворотках крови.

6.3.6 Метод иммуноцитохимической детекции ротавируса

Метод основан на иммунохимическом определении вирусного антигена синтезирующегося в клетках в результате их заражения вирус-содержащим материалом.

Преимущество метода по сравнению с ИФА заключается в более высокой чувствительности, а также возможности определить и количественно оценить инфекционность исследуемой пробы.

Постановка опыта: перевиваемые клетки почки зеленой обезьяны в 5

концентрации  3 - 10  кл/мл вносят по 0,2 мл в лунки плоскодонных панелей и
инкубируют  при  37 °C  (24 - 48  час.).   Затем  клетки   промывают средой
Игла-МЕМ.  Тестируемый  материал  разводят  в  среде  Игла-МЕМ,  активируют
в течение 1 часа при  37  °C  в присутствии 10 мкг/мл трипсина  и вносят по
0,1 мл не менее чем  в  4  лунки.  Положительным  контролем  служат  лунки,
в которые внесен материал,  заведомо  содержащий  ротавирус.  Отрицательные
контроли:  лунки  с  незараженными  клетками  и  лунки,  в  которые  внесен
материал, аналогичный исследуемому,  но заведомо не содержащий ротавирусов.
Адсорбцию проводят в течение 1 часа при 37 °C,  затем среду удаляют, клетки
промывают  средой  Игла-МЕМ.  В лунки  вносят  по  0,2 мл  среды Игла-МЕМ с

1 мкг/мл трипсина и инкубируют 48 часов при 37 °C.

Клетки дважды промывают физиологическим раствором и фиксируют охлажденным (-20°) 85% ацетоном, выдерживают 2 часа при -20°, затем ацетон удаляют. Панель отмывают 3 раза ФСБ, содержащим 0,05% Твина 20 (ФСБ-Т). В лунки вносят по 0,1 мл разведенной 1:1000 в ФСБ-Т иммунной антиротавирусной сыворотки кролика. Инкубируют 2 часа при 37 °C. После отмывания панели в лунки вносят по 0,1 мл препарата меченных пероксидазой антител против IgG-кролика (коммерческий препарат), в концентрации 2 мкг/мл по содержанию пероксидазы в ФСБ-Т с 1% БСА и инкубируют 1,5 часа при 37 °C.

Панель отмывают 2 раза ФСБ-Т и 1 раз 0,05 М ацетатным буфером, pH 5,0. В лунки вносят по 0,1 мл свежеприготовленного раствора субстрата пероксидазы, содержащего на 10 мл ацетатного буфера/4 мг 3-амино-9-этилкарбазола (АЭК), растворенного в 0,5 мл ацетона, и 0,01 мл 33% перекиси водорода (Внимание! Работа с АЭК требует осторожности). Инкубируют 30 — 40 мин. в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливают, отмывая панель дистиллированной водой.

Учет реакции проводят под световым микроскопом с малым увеличением. Лунки с отрицательными контролями не должны содержать окрашенных клеток. Локальные скопления окрашенных клеток представляют собой фокусы вирусной инфекции.

6.3.7 Метод иммунофлюоресценции

Для выявления антигена ротавируса методом иммунофлюоресценции используют линию клеток 4647. Клетки выращивают на покровных или предметных стеклах, вложенных в пенициллиновые флаконы или пробирки. Инфицированную культуру инкубируют при 37 °C в течение 24 — 48 часов, после чего стекла извлекают из флаконов, промывают в 0,15 М физиологическом растворе с добавлением фосфатного буфера при pH 7,2, споласкивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Затем препараты фиксируют в двух сменах (по 10 мин. в каждой) химически чистого охлажденного до 4 °C ацетона.

Препараты обрабатывают по непрямому методу во влажной камере. На клетки культуры наносят по одной капле иммунной ротавирусной сыворотки кролика и выдерживают 30 мин. при 37 °C, затем препараты отмывают трехкратно в ФСБ и удаляют избыток влаги. Влажные препараты окрашивают смесью равных объемов антивидового ФИТЦ-конъюгата и бычьего альбумина, меченного родамином, и инкубируют в течение 30 мин. при 37 °C. После 3-кратной промывки в ФСБ препараты высушивают на воздухе. В целях устранения неспецифической флюоресценции антивирусную сыворотку перед употреблением адсорбируют гомогенатом нормальной клеточной культуры, а ФИТЦ — конъюгат обрабатывают активированным углем по общепринятым методикам.

В качестве обязательных контролей используют: обработанные аналогичным способом препараты незараженных культур и препараты зараженных культур, обработанные на первом этапе нормальной, а также гетерологичной антивирусной сывороткой той же видовой принадлежности, что и иммунная сыворотка к ротавирусу.

В случае положительных результатов в цитоплазме клеток наблюдают отчетливую ярко-зеленую флюоресценцию.

6.4 Метод электрофоретипирования ротавирусов

Метод основан на идентификации ротавирусов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле вирусных геномных РНК-сегментов. Метод позволяет дифференцировать штаммы ротавирусов на основании различий в электрофоретической подвижности индивидуальных РНК-сегментов различных изолятов, в связи с чем широко применяется в эпидемиологических исследованиях. Метод не требует предварительного культивирования изолятов, обладает высокой чувствительностью и абсолютной специфичностью.

Метод представляет особый интерес для врачей-эпидемиологов при расследовании групповых заболеваний вспышек ротавирусной инфекции.

Может быть осуществлен на базе лабораторий, оснащенных аппаратами для электрофореза.

Для проведения анализа достаточно 0,2 — 0,5 мл 10 — 20% суспензии фекалий. Суспензии обрабатывают фреоном 113 и инкубируют с проназой (0,2 мг/мл, 15 мин.) в присутствии додецил-сульфата натрия (1%) и этилендиаминтетраацетата натрия (0,001 М). После добавления ацетата натрия (0,3 М) РНК депротеинизируют смесью фенол: хлороформ-изоамиловый спирт и осаждают 2,5 объемами этанола (18 ч при -20 °C или 2 ч при -70 °C). Осадок собирают центрифугированием, растворяют в воде и добавляют диссоциирующий буфер. Электрофорез проводят по метолу Лэммли в пластинах 10% геля. Для окрашивания РНК в геле обычно используют нитрат серебра (0,011 М). После процедуры проявления в геле видны 11 полос РНК, соответствующих геномным сегментом ротавируса.

6.5 Определение иммуноглобулина класса М в сыворотке

больного при ротавирусной инфекции методом твердофазной реакции коагглютинации (ТРКА)

При этом используется принцип твердофазной реакции коагглютинации (см. 4.3.4) в модификации: для сенсибилизации лунок панели используют 0,1 мл коммерческой бараньей моноспецифической сыворотки против IgM человека, в разведении 1:1000. Панели инкубируют 2 — 4 часа при 37 °C. Затем лунки промывают ФСБТ, заполняют 3% раствором желатина и оставляют на 30 минут при 37 °C. Лунки отмывают ФСБТ и вносят по 0,05 мл исследуемых, а также заведомо положительных и отрицательных сывороток, разведенных 1:100 ФСБТ (по 2 лунки для каждой сыворотки). При определении титра антител исследуют двухкратные разведения тестируемых образцов (1:10 — 1:1280). Панели инкубируют 2 часа при 37 °C и после отмывания в парные лунки вносят по 0,05 мл диагностикума и контрольного реагента. Реакцию учитывают через 1 — 2 часа (см. выше 4.3.4).

Этот же принцип, модифицированный ТРКА, используют для тестирования IgA и IgG антител при ротавирусной инфекции, а также при анализе молозива и молока на лактроглобулины.

Используется метод определения иммуноглобулина класса М в сыворотке больного как для ранней диагностики манифестных форм, так и дифференциальной диагностики их с бессимптомными формами ротавирусной инфекции.

7. Противоэпидемические мероприятия

Каждый случай заболевания острой кишечной инфекцией, вызванной ротавирусами, в первую очередь детей первого года жизни, а также детей, посещающих дошкольные детские учреждения, нуждается в тщательном эпидемиологическом анализе для выявления источника, основных путей и факторов передачи инфекции с целью своевременного проведения, комплекса противоэпидемических мероприятий в очаге.

Мероприятия, направленные на выявление и обезвреживание источника инфекции. Выявление больных, подозрительных на заболевание, проводится врачами всех учреждений здравоохранения: во время амбулаторных приемов, посещений на дому, медицинских осмотров детей в детских учреждениях, стационарах и др. Выявленные больные изолируются из детских коллективов. Медицинское наблюдение и лечение больных могут проводиться в домашних условиях или в стационаре. Дети, посещающие детские учреждения, выписанные из больницы или закончившие лечение на дому с отрицательными результатами лабораторного обследования, допускаются в детские коллективы на основании справки врача-педиатра. Дети, переболевшие РГ и продолжающие выделять ротавирусы (или ротавирусный антиген) с фекалиями без клинических проявлений инфекции, могут быть допущены в детские сады и садиковые группы детских яслей-садов при условии организации постоянного медицинского наблюдения за ними и повторного лабораторного обследования на 2 — 3 неделе от начала заболевания или выделения вируса.

Эпидемиологическое обследование семейных очагов больных РГ проводится при заболевании детей в возрасте до 2-х лет и взрослых из числа декретированных контингентов. В детское учреждение врач-эпидемиолог выходит с обследованием при появлении повторных случаев небактериального гастроэнтерита.

---