Методические указания по лабораторным исследованиям на пироплазмидозы животных
(утв. Минсельхозпродом России 16.12.1996 № 13-7-2/799)
Утверждаю Заместитель начальника Департамента ветеринарии
В. В. Селиверстов
16 декабря 1996 г. № 13-7-2/799
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ НА ПИРОПЛАЗМИДОЗЫ ЖИВОТНЫХ
1. Общие положения
1.1. Пироплазмидозы (бабезиоз, тейлериоз) — протозойные болезни животных, вызываемые возбудителями отряда Piroplasmida. Возбудители пироплазмидозов обладают видовой специфичностью.
Бабезиоз вызывают: у лошадей Babesia caballi (Piroplasma caballi), B. Equi (Nuttallia equi); у крупного рогатого скота — B. bovis (Fransaiella colchica), B. bigemina (P. bigeminum), B. divergens (B. Bovis); у овец и коз — B. ovis, B. motasi (P. ovis); у собак — B. canis (P. canis).
Тейлериоз вызывают: у крупного рогатого скота — Theilezia annulata и Th. sergenti; у овец и коз — Th. Ovis.
Заболевания протекают остро, подостро, хронически и сопровождаются лихорадкой, анемией, желтушностью и кровоизлиянием на слизистых оболочках, гемоглобинурией (при бабезиозе), увеличением лимфатических узлов (при тейлериозе) и заканчиваются нередко гибелью.
1.2. Диагноз на пироплазмидозы ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов микроскопического исследования.
1.3. Лабораторные исследования на пироплазмидозы включают: микроскопию мазков крови, внутренних органов, головного мозга, пунктатов лимфатических узлов; дифференциацию возбудителей.
2. Отбор и пересылка материала для исследования.
2.1. В лабораторию для исследования направляют: от подозреваемых в заболевании или больных животных — тонкие мазки крови из периферических сосудов уха, хвоста или венчика, на тейлериоз дополнительно — мазки из пунктатов лимфатических узлов; от павших или убитых — часть печени, легких, селезенки, почки, гепатита головного мозга и лимфатические узлы.
2.2. Мазки крови берут в период развития симптомов болезни, при повышенной температуре, до применения специфического лечения.
2.2. Перед отбором материала у животного шерсть на месте взятия крови выстригают, кожу тщательно протирают в начале ватным тампоном, смоченным в растворе спирта, а затем сухим. Стерильной иглой делают прокол вены ушной раковины или ножницами надрезают край верхушки уха или хвоста. К свободно выступившей капле крови легко прикасаются поверхностью сухого обезжиренного предметного стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают пальцами, левой руки в горизонтальном положении. Шлифованным краем другого предметного или покровного стекла прикасаются к капле крови. Как только кровь равномерно распределится по ребру этого стекла, его быстро проводят по поверхности стекла справа налево под углом 45°. Ширина мазка должна быть уже предметного стекла. Для каждого НОВОГО мазка берут свежую каплю крови. От каждого животного готовят по 2 мазка.
Готовые мазки крови высушивают на воздухе; подсушивать их над пламенем или на солнце нельзя. В холодное время года мазки делают в теплом помещении или на стеклах, подогретых на крышке стерилизатора.
Правильно приготовленные мазки крови должны быть тонкие, равномерные, достаточной длины и заканчиваться за 0,5 — 1,0 см от края стекла.
2.4. При взятии пунктата из лимфатического узла животное хорошо фиксируют, на месте пункции выстригают шерсть, кожу протирают ватным тампоном, смоченным в растворе спирта или настойке йода. Левой рукой оттягивают лимфатический узел и удерживают большим и указательным пальцами левой руки. Затем вглубь узла вводят стерильную иглу, надевают на нее шприц и поршнем отсасывают лимфу. После шприц отсоединяют, иглу извлекают, а содержимое шприца выдавливают поршнем на предметное стекло, делая тонкие мазки, которые высушивают на воздухе.
2.5. На высушенных мазках крови и пунктата острым предметом или простым карандашом пишут номер, вид животного и дату приготовления мазка.
2.6. Материал от павших или убитых животных отбирают до наступления трупного окоченения.
2.7. Мазки упаковывают в чистую бумагу, патологический материал — во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в день отбора.
3. Микроскопическое исследование
3.1. Из доставленного для исследования патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта.
3.1.1. Мазки из головного мозга готовят путем заключения мелких кусочков между предметными стеклами. После растирания помещенного между ними материала стекла разъединяют в противоположные стороны в горизонтальном направлении, в результате чего получаются два довольно тонких мазка. Мазки высушивают на воздухе.
3.1.2. Из паренхиматозных органов готовят мазки-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков, мазки-отпечатки высушивают на воздухе.
3.2. Мазки фиксируют этиловым ректификованным спиртом 96°-ным в течение 20 — 25 мин. или смесью этилового спирта и серного эфира в равных количествах — 10 — 15 мин. После высушивания мазки окрашивают азур-эозином по Романовскому — Гимзе (краску разводят дистиллированной водой pH 7,0 — 7,2 — в соотношении 1:10) — 30 — 45 мин. (в зависимости от качества краски и температуры помещения), промывают дистиллированной водой pH 7,0 — 7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа (x90). Качество окраски мазка определяют под микроскопом по окраске лейкоцитов. Если лейкоциты бледно окрасились или не окрасились, исследовать препарат бесполезно, необходимо применить другую серию краски.
3.3. При микроскопии обнаруживают бабезии в эритроцитах, тейлерии и Б. екви — еще в клетках лимфоидной ткани в виде различной формы шизонтов. Цитоплазма пироплазмид окрашивается в голубовато-синеватый цвет, глыбки хроматина — в красно-фиолетовый или красный.
4. Дифференциальная диагностика возбудителей и оценка результатов.
4.1. Пироплазмид дифференцируют между собой (по форме, углу соединения парных форм, соотношение их размера и радиуса эритроцита, локализации в эритроците), а также от анаплазм и эперитрозоон. При определении пользуются следующей таблицей:
4.2. Результат исследования считают положительным при обнаружении в препарате из исходного материале возбудителей пироплазмидозов.
5. Срок микроскопического исследования до 2 дн.
Методические указания по лабораторным исследованиям на пироплазмидозы животных разработаны сотрудниками Всероссийского института экспериментальной ветеринарии и Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории.
Приложение к «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на пироплазмидозы животных»
ПИРОПЛАЗМИДОЗЫ ЖИВОТНЫХ (СПРАВКА)
Пироплазмидозы — протозойные болезни животных, вызываемые возбудителями отряда Piroplasmida. Пироплазмиды — одноклеточные простейшие организмы со сложной структурой и жизненным циклом. Возбудители паразитируют у позвоночных и клещей; у первых пироплазмиды размножаются в эритроцитах и клетках лимфатической системы (тейлерии, бабезия екви), цикл развития возбудителей в организме клещей-переносчиков полностью не расшифрован.
Эпизоотология. Характерной особенностью возбудителей пироплазмидозов является их специфичность к определенным видам хозяев.
Болезнь проявляется там, где имеются зараженные соответствующим видом возбудителя клещи-переносчики, паразитоносители и восприимчивые животные. Сезон заболевания животных совпадает с периодом активной фазы клещей-переносчиков, являющихся одним из главных звеньев в эпизоотической цепи. В естественных условиях пироплазмидозы возникают только в результате паразитирования зараженного соответствующим видом клеща-переносчика. Следовательно взаимный обмен возбудителями между теплокровным хозяином и клещом-переносчиком обусловливает сохранение возбудителей в пироплазмидозных очагах. На территории страны встречаются 6 родов клещей, которые обитают в определенных микроклиматических условиях.
Патогенез. Возбудитель болезни попадает в организм восприимчивого животного со слюной клеща-переносчика во время питания на животном.
Размножение возбудителей бабезиоза в организме восприимчивого животного происходит в эритроцитах капилляров внутренних органов, затем в эритроцитах кровяного русла. Паразиты питаются за счет эритроцитов путем осмоса. Выделяемые паразитами продукты межуточного обмена вызывают нарушение функции органов кроветворения, нарушается кровообращение, возникает застой в малом кругу кровообращения, появляется одышка, на почве застойных явлений происходит расстройство деятельности внутренних органов, нарушается обмен веществ, возникает порозность стенок сосудов и появляются кровоизлияния на слизистых, серозных оболочках, во внутренних органах; расстройство работы сердца и других органов часто приводит к отеку легких, затем и к гибели животного.
При тейлериозе возбудитель, попавший в организм животного размножается вначале в лимфатических узлах, затем в паренхиматозных органах и внедряется в эритроциты.
Симптоматика. Первые признаки болезни проявляются через 8 — 12 дней после нападения зараженных клещей. У животных отмечают высокую температуру, угнетение, потерю аппетита, анемию, нередко желтушность; при бабезиозе — гемоглобинурию, нарушение функции сердца, желудочно-кишечного тракта и других органов вменяется морфологический состав крови. Продолжительность болезни 1 — 3 недели. Если животные пали, то выздоравливание проходит медленно. Смертность племенного и привозного крупного рогатого скота при тейлериозе выше, чем при бабезиозе. Переболевшие животные годами остаются носителями возбудителей и в течение всего этого периода они невосприимчивы к повторному заражению одноименным возбудителем при ежегодном с ним контактировании.
Патанатомия. При вскрытия часто обнаруживают желтушность тканей, кровоизлияния на серозных и слизистых оболочках и в мышце сердца. Лимфатические узлы, селезенка увеличены, с кровоизлияниями, печень увеличена, желчный пузырь растянут, мочевой пузырь наполнен мочой красноватого цвета (при бабезиозе), в слизистых оболочках сычуга, иногда кишечника, имеются язвы (при тейлериозе).