Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных

(утв. Минсельхозпродом России 30.06.1999 № 13-7-2/643)

Утверждаю Заместитель руководителя Департамента ветеринарии

1. Общие положения

1.1 Лабораторные методы исследования на хламидийные инфекции животных включают:

• выделение хламидий на куриных эмбрионах, в культуре клеток или лабораторных животных с последующей их идентификацией;
• выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2 В лабораторию для исследования на хламидийные инфекции направляют:

• сыворотку крови в количестве 3 — 5 куб. см от абортировавших или подозрительных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14 — 21 день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1 — 2 куб. см. Сыворотки хранят при температуре минус 20 °С и исследуют одномоментно. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой непригодны;

Флаконы с патматериалом помещают в термос со льдом, а абортированные плоды во влагонепроницаемую тару и в тот же день, но не позже 24 часов, доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих распространение возбудителя инфекции.

2. Серологические исследования

2.1. Серологические исследования на хламидийные инфекции основаны на выявлении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК) и методом иммуноферментного анализа (ИФА); у абортировавших животных — на установлении нарастания титра антител в 4 и более раз.

Животных, вакцинированных против хламидийного аборта, серологически не исследуют в течение 1 года после вакцинации.

2.2 В РСК, РДСК используют следующие компоненты:

• комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген;
• контрольный антиген;
• позитивную (иммунную) сыворотку крови овец, содержащую группо-специфические хламидийные антитела;
• негативную (отрицательную) сыворотку крови овец;
• комплемент (свежая, консервированная или лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки);
• гемолизин (сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана);
• эритроциты барана;
• испытуемые сыворотки;
• физиологический раствор, рН 7,0 — 7,2.

Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах.

Антиген разводят в дистиллированной воде и применяют в РСК, РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.

2.3. Гемолизин в РСК и РДСК используют в удвоенном титре (например, при титре гемолизина 1:1000 его берут 2:1000).

2.5. Для серологического исследования пригодны лишь свежие испытуемые сыворотки. Допускаются к исследованию и однократно замороженные, а также сыворотки, консервированные борной кислотой (2% к объему) или мертиолятом (1:10000).

Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

2.6. Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2 — 7,4) готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.

2.7 Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

2.7.1. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Комплемент титруют каждый раз перед постановкой главного опыта на позитивной и 1 — 2 испытуемых сыворотках.

2.7.2. Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на этикетке, и готовят основное разведение 1:20.

Каждую сыворотку, разведенную 1:5 (1 куб. см сыворотки + 4 куб. см физиологического раствора) инактивируют при 58 — 60 °С 30 мин., разливают по 0,2 куб. см в два ряда пробирок штатива Флоринского. Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 куб. см до 0,2 куб. см с интервалом по 0,02 куб. см. Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят разведенный 1:20 комплемент в десятикратном объеме в дозах 0,2; 0,4; 0,6 и т.д. до 2,0 куб. см и добавляют в каждую пробирку недостающее до 2 куб. см количество физиологического раствора, т.е. 1,8; 1,6; 1,4 и т.д. Затем из первого разведения комплемента переносят по 0,2 куб. см в первые пробирки всех сывороток, из второго разведения соответственно во вторые и т.д. (это можно выполнять аппаратом Флоринского с мерными пипетками по 0,2 куб. см).

Первые ряды пробирок с позитивной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении в антигенные ряды по 0,2 куб. см, а во вторые ряды — по 0,2 куб. см физраствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 мин. при 37 — 38 °С.

Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 куб. см, встряхивают и ставят в водяную баню на 20 мин. при 37 — 38 °С (схему титрования комплемента см. в таблице 1).

Таблица 1

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (ПО ПЕРВОМУ РЯДУ ПРОБИРОК)

Компоненты	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комплемент в разведении 1:20	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,2
Физиологический раствор	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Антиген специфический в рабочем титре	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Сыворотка в разведении 1:5	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяная баня 30 мин. при 37 — 38 гр. С
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 20 мин. при 37 — 38 гр. С
Дополнительный ряд пробирок для предварительного разведения комплемента
Комплемент 1:20	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
Физиологический раствор	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	0,6	0,4	0,2	-

Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает полный гемолиз эритроцитов с испытуемыми сыворотками в пробирках первого и второго рядов и позитивной сывороткой — в пробирках второго ряда (без антигена).

В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, равен 0,1 куб. см, что и будет является его рабочей дозой.

Таблица 2

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА (ПРИМЕР)

№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Дозы комплемента в разведении 1:20	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,2
Позитивная сыворотка
1 ряд	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	++++	++++
2 ряд	++++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
Сыворотка № 1 из опыта
1 ряд	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+++	++	+	+
2 ряд	++++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
Сыворотка № 2 из опыта
1 ряд	+++++	+++	++	+	-	-	-	-	-	-
2 ряд	+	++	+	-	-	-	-	-	-	-

Примечание: если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более чем на два интервала по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки содержат специфические к данному антигену антитела и, в таком случае, рабочую дозу комплемента определяют по безантигенным рядам позитивной и испытуемых сывороток.

Расчет количества чистого комплемента, необходимого для постановки главного опыта, делают по формуле:

                               А х В

-----, С

где:

А — рабочая доза комплемента;

В — количество пробирок, занятых в реакции;

С — основное разведение комплемента.

Пример: (0,1 x 100): 20 = 0,5.

Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 куб. см (0,2 x 100), поэтому к 0,5 куб. см чистого комплемента следует добавить 19,5 куб. см физиологического раствора.

2.7.3. Главный опыт РСК. Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1:5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56 — 65 °С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37 — 38 °С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин., второй этап реакции (с гемолитической системой) — 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

• позитивная сыворотка в разведении 1:5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1:5 до ее титра со специфическим антигеном;
• негативная сыворотка в разведениях 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном, в разведении 1:5 с контрольным антигеном и без антигена — антигены специфический и контрольный в двойной дозе — на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент -);
• гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент -).

Схема постановки главного опыта представлена в таблице 3.

Таблица 3

СХЕМА ГЛАВНОГО ОПЫТА РСК

Компоненты реакции	№ пробирок				Контроли
	1	2	3	4	антиген специфический		антиген контрольный		гемолитическая система
	разведение сыворотки				на антикомплементарность	на гемотоксичность	на антикомплементарность	на гемотоксичность
	1:5	1:5	1:5	1:10
Испытуемая сыворотка	0,2	0,2	0,2	0,2	-	-	-	-	-
Физиологический раствор	0,2	-	-	-	-	0,2	-	0,2	0,6
Контрольный антиген	-	0,2	-	-	-	-	0,4	0,4	-
Специфический антиген	-	-	0,2	0,2	0,4	0,4	-	-	-
Комплемент в рабочем титре	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-	0,2	-	-
Водяная баня 30 мин. при 37 — 38 гр. С
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 20 мин. при 37 — 38 гр. С
Результат реакции (положительный)	-	-	++++	++++	-	++++	-	++++	++++

2.8 Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

2.8.1. Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2 — 6 °С в течение 16 — 18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин. при 37 — 38 °С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при определении его рабочего разведения). Если рабочий титр комплемента неизвестен или вызывает сомнение, перед титрованием гемолитической системы для РДСК определяют его рабочее разведение по схеме, представленной в таблице 4.

Таблица 4

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАБОЧЕГО РАЗВЕДЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ДЛЯ РДСК

Компоненты реакции	№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	разведение комплемента
	1:10	1:10	1:20	1:30	1:40	1:50	1:60	1:70	1:80	1:90
Комплемент чистый	0,2	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Физиологический раствор	1,8	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Комплемент 1:10 из 1-й пробирки	-	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Физиологический раствор	-	-	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8
	из пробирок удаляют лишнее количество, доводя до объема 0,2
	-	-	-	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7
Комплемент в разведениях		0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор		0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Гемолитическая сыворотка		0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
	водяная баня 10 — 15 минут
	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	НГ	НГ

Затем в первые ряды пробирок каждой сыворотки вносят по 0,2 куб. см антигена в рабочем разведении, а во вторые ряды — 0,2 куб. см физиологического раствора;

во все пробирки разливают по 0,2 куб. см комплемента в зависимости от его рабочего разведения, встряхивают и помещают в холодильник на 16 — 18 час. при температуре 2 — 6 °С.

Компоненты реакции	Ряды пробирок	№ пробирок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Позитивная, негативная или испытуемая сыворотка в разведении 1:5	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	первый	-		-	-	-	-	-	-	-	-
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Специфический антиген	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Комплемент в рабочем разведении (1:25, 1:30)	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Холодильник 16 — 18 часов при 37 — 38 гр. С.
Гемолитическая система	первый	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
	второй	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
Водяная баня 20 минут при 37 — 38 гр. С.
Примерный результат по негативной сыворотке	первый	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ
	второй	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ

Таблица 6

СХЕМА ГЛАВНОГО ОПЫТА РДСК

Компоненты реакции	№ пробирок				Контроли
	1	2	3	4	Антиген специфический		Антиген контрольный		Гемолитическая система
	разведение сыворотки				на антикомплементарность	на гемотоксичность	на антикомплементарность	на гемотоксичность
	1:5	1:5	1:5	1:10
Испытуемая сыворотка	0,2	0,2	0,2	0,2	-	-	-	-	-
Физиологический раствор	0,2	-	-	-	-	0,2	-	0,2	0,6
Контрольный антиген	-	0,2	-	-	-	-	0,4	0,4	-
Специфический антиген	-	-	0,2	0,2	0,4	0,4	-	-	-
Комплемент в рабочем разведении (1:25, 1:30)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-	0,2	-	-
Холодильник 16 — 18 часов при 2 — 6 гр. С и 20 — 30 минут при комнатной температуре
Гемолитическая система	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Водяная баня 20 минут при 37 — 38 гр. С
Результат реакции (положительный)	-	-	++++	++++	-	++++	-	++++	++++

2.9. При массовых постановках РДСК испытуемые сыворотки исследуют только со специфическим антигеном в разведении сыворотки 1:5 (0,05 куб. см сыворотки + 0,2 куб. см физиологического раствора) с последующей перестановкой сомнительно и положительно реагирующих проб, как указано в п. 2.7 и 2.8.

Допускается:

• при работе с аппаратом Флоринского для разведения сыворотки 1:5 к 0,05 куб. см сыворотки добавлять 0,2 куб. см физраствора;
• перед разливом компонентов в РСК и РДСК — смешивание равных объемов антигена и комплемента в рабочих разведениях.

2.10. Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз — сразу после водяной бани, второй — после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3 — 4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2 до 6 °С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

Компоненты реакции	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Гемолизированная жидкость	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Физиологический раствор	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Процент гемолиза	10	20	30	40	50	60	70	80	90

«Стандартную » шкалу готовят перед учетом реакции.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в «стандартных» пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) — гемолиз 25% эритроцитов;

++ (2 креста) — гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) — гемолиз 75% эритроцитов;

• (минус) — полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

2.11 Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3 — 4 креста в разведении 1:10.

Сомнительной — при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1:10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1:5.

Отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1:5 и 1:10.

2.12. Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

3. Постановка ИФА

3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики хламидиозов животных и эпизоотологического обследования поголовья путем выявления специфических антител в сыворотках крови больных животных.

3.3 Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:

3.3.1 В состав набора входят:

2 — специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная — 1 амп.;

3 — отрицательная сыворотка, лиофилизированная — 1 амп.;

4 — пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный — 1 амп.

Химический набор, в состав которого входят:

5 — КН2Р04 — 1 амп.;

6 — К2НР04 — 1 амп.;

7 — NaCl — 1 амп.;

8 — Твин-20 (-40,-80, Тритон Х-100) — 1 амп.;

9 — лимонная кислота — 1 амп.;

10 — КН2Р04 — 1 амп.;

11 — 0-фенилендиамин — 2 амп.;

12 — гидроперит — 1 табл.;

13 — две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;

14 — стоп-раствор -1 флакон.

3.3.2 Оборудование:

1 — одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 куб. см до 1 куб. см;

2 — стеклянные пипетки на 1 — 2 куб. см;

3 — промывающее устройство;

4 — спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.

3.4 Приготовление рабочих растворов:

• Буфер № 1 — (0,01 М калий фосфатный, pH 7,2 — 7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 куб. см дистиллированной воды, фильтруют, проверяют pH. При необходимости pH корректируют 0,1 № KOH или HCl.
• Буфер № 2 — предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 куб. см буфера № 1 добавляют содержимое ампулы № 8.
• Буфер № 3 — (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовления субстрата (pH 5,0 — 5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.

А — содержимое ампулы № 9 растворить в 50 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе.

Б — содержимое ампулы № 10 растворить в 50 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 куб. см раствора А добавить 25,7 куб. см раствора Б и 50 куб. см дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) компоненты буфера до установления требуемого pH. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы № 11 растворить в 2 куб. см спиртаректификата и добавить 48 куб. см буфера № 3, внести 0,8 куб. см перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки № 12 в 10 куб. см дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4 — 6 °C не более 3 мес.

3.4.2 Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 куб. см буфера № 1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб. см буфера № 2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб. см буфера № 2, получая разведение 1:200.

Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 4 — 6 °С в течение 3 — 4 дней.

3.4.3 Разведение проб сыворотки крови.

Испытуемую сыворотку крови разводят 1:200 буфером № 2 в отдельных пробирках или микропанели.

3.5 Постановка иммуноферментной реакции.

3.5.1 Сорбция антигена на микропанели.

3.5.2 Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером № 2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4 — 5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.

3.5.3 Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда A1, B1, C1 вносят по 0,1 куб. см специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки D1, E1, F1 вносят по 0,1 куб. см отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п. 3.4.2. В лунки G1, H1, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 куб. см буфера № 2. В горизонтальные ряды A, E вносят, начиная с лунок A2 и E2 по 0,2 куб. см исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с разведения 1:200 до 1:6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С в термостате в течение часа.

3.5.4 Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 куб. см рабочего раствора иммуноферментного конъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате при 37 °С в течение 1 часа.

3.5.5 Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.

3.5.6 Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4.1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 куб. см субстратно-индикаторного раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 — 40 мин.

В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.

3.6 Учет результатов реакции.

Результаты учитывают в течение 30 — 40 мин. после внесения стоп-раствора.

3.6.1. Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле.

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

3.6.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП490).

Положительными считаются пробы, ОП490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы — ОП490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150 — 0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствует об отрицательной реакции.

3.7 Интерпретация результатов ИФА.

4. Обнаружение, выделение и идентификация хламидий и антигенов хламидий

4.1 Обнаружение хламидий.

Для обнаружения хламидий из доставленного патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки для световой и люминесцентной микроскопии.

4.1.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала методом световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по Романовскому-Гимзе.

При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе препараты фиксируют 96% этиловым (метиловым) спиртом или охлажденным безводным ацетоном в течение 5 мин. и окрашивают краской Романовского-Гимзе, разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (pH 7,2 — 7,6) в течение 1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом микроскопе под иммерсионным объективом. Цитоплазматические включения представляют компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии клетки, имеют разнообразную правильную или неправильную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со средним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, крупные включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры возбудителя имеют розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявляются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических структур микроорганизма, обнаруживается содержащая их вакуоль.

4.1.2 Метод прямой и непрямой иммунофлуоресценции (ИФ).

Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят непосредственно после взятия материала с конъюнктивы и гениталий животных, используя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией.

Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят на лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют, указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин. или наносят на мазок 2 — 3 капли ацетона до полного его испарения. Стекло с фиксированным препаратом может храниться при температуре 18 — 20 °C в течение 5 сут.

4.1.3 Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав которого входят:

• компонент № 1 — лиофилизированные моноклональные антитела, меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета -1 флакон, 0,1 куб. см;
• компонент № 2 — растворитель для лиофилизированных иммуноглобулинов, прозрачная бесцветная жидкость — 1 флакон, 3,0 куб. см;
• компонент № 3 — жидкость для «заключения» препарата, вязкая прозрачная маслянистая жидкость -1 флакон, 2,0 куб. см.

Оборудование:

• люминесцентный микроскоп;
• термостат на 37 °С;
• чашки Петри;
• предметные стекла с лункой;
• фильтровальная бумага;
• микропипетка на 30 мкл;
• наконечники в штативе.

4.1.4. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку предметного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипетки вносят 30 мкл меченных ФИТЦ моноклональных антител. С помощью наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по всей поверхности лунки с материалом.

4.1.5. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реагентом инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре 37 +/- 0,5 °С в течение 30 мин., периодически проверяя их состояние во избежание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложноположительным результатам при диагностике, поэтому высохшие препараты бракуются.

4.1.6. Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10 с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.

4.1.7. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости для «заключения» препарата (компонент № 3), покрывают обезжиренным покровным стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микроскопе при комбинации светофильтров С3 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при использовании окуляра Х 10 и объектива с масляной иммерсией Х 90, с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомендуется просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные препараты можно хранить при температуре 2 — 8 °С не более 24 ч.

4.1.8. Учет результатов ПИФ. Диагноз на хламидиоз считается положительным, если в препарате диагностируют наличие элементарных телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые образования округлой формы с ровными краями, размером около 300 мкм (приблизительно 1/100 от окружающих эпителиальных клеток). Иногда наблюдаются ретикулярные тельца хламидий, размеры которых в 2 — 3 раза больше элементарных. Внутриклеточные включения выявляются не более, чем в 10% случаев.

Диагноз на хламидиоз считается отрицательным, если в препарате отсутствует специфическое ярко-зеленое свечение при наличии окрашенных в красный цвет эпителиальных клеток. Для того, чтобы отрицательный диагноз можно было считать достоверным, рекомендуется просматривать все поле мазка не менее 5 мин.

В качестве отрицательного контроля проводят микроскопию мазков, приготовленных из конъюнктивы заведомо здоровых животных, специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток должно отсутствовать.

Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или другого цвета, а также имеющий неяркую зеленую окраску, рассматривается как артефакт.

4.1.9. При исследовании препаратов непрямым методом ИФ на фиксированный мазок или мазок-отпечаток наносят иммунную хламидийную нефлуоресцирующую сыворотку и выдерживают его во влажной камере при тех же условиях. Затем промывают физиологическим раствором и высушивают.

Для контроля на другой препарат наносят контрольную отрицательную сыворотку, выдерживают во влажной камере, затем окрашивают флуоресцирующей антивидовой сывороткой.

При наличии в препаратах антигена хламидий обнаруживают специфическое свечение в виде желто-зеленых гранул округлой и овальной формы на тусклом зеленовато-сером фоне. В контрольном препарате специфическое свечение должно отсутствовать.

5. Выделение хламидий

Выделение хламидий проводят на куриных эмбрионах или лабораторных животных.

5.1. Для заражения эмбрионов из патологического материала готовят 10% суспензию на физиологическом растворе pH 7,2 — 7,4 и центрифугируют ее при 2000 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками: 10 ед./куб. см пенициллина и 500 ед./куб. см стрептомицина или 150 мкг/куб. см гентамицина.

Пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи используют в цельном виде или разводят (1:2), которые обрабатывают вышеуказанными антибиотиками. Затем выдерживают в холодильнике при 4 °С в течение 2 — 4 час и высевают на питательные среды (МПБ, МПА) для исключения бактериального загрязнения.

Через сутки при отсутствии роста микрофлоры на питательных средах исследуемый материал вводят 6 — 7 дневным куриным эмбрионам в желточный мешок в дозе 0,2 куб. см. Каждым материалом заражают не менее 6 эмбрионов.

Эмбрионы инкубируют в термостате при 37 °С и относительной влажности 75%.

Гибель эмбрионов в течение 72 час после заражения считают неспецифической.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12 день вскрывают и проводят следующий пассаж по общепринятой методике, используя для заражения центрифугат 10% суспензии желточных мешков.

Эмбрионы, погибшие на 4 — 12 день после заражения, вскрывают. Аллантоисную жидкость проверяют на бактериальную контаминацию путем высева на питательные среды (МПБ, МПА). Желточные мешки эмбрионов отбирают в стерильную посуду и из каждого готовят мазки-отпечатки.

Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения и идентификации хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в желточных мешках куриных эмбрионов, павших на 4 — 12 день после заражения, в любом из трех последовательных пассажей.

5.2. Для культивирования хламидий используют перевиваемые культуры клеток (McCoy, L-929, Hela). Заражение культуры проводят соскобным материалом, полученным со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Первичный инфекционный материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими 2 куб. см 199 среды с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота и 5% 0,5 М раствором глюкозы. Для подавления сопутствующей бактериальной флоры в инфекционный материал

добавляют стрептомицин (200 мкг/ куб. см), канамицин (100 мкг/мл) и нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками продолжается от 3 до 18 часов при температуре 4 °С, в отдельных случаях материал до заражения хранят при минус 70 °С. Обработанный антибиотиками материал вносят по 0,3 куб. см в 4 — 5 плоскодонные пробирки с монослоем клеток, выращенных на покровных стеклах и предварительно обработанных ДЕАЕ-декстраном (90 мкг) на 30 мин, центрифугируют при 2400 об/мин в течение 1 часа при температуре (33 — 34) °С. Инокулят удаляют, культуру заливают свежей средой того же состава и инкубируют при температуре 35 °С. Индикацию хламидий проводят через 48, 72 часа, а в отдельных случаях через 24 часа. С этой целью покровные стекла извлекают из пробирок, фиксируют в 96° этаноле в течение 10 — 15 мин. и окрашивают по Романовскому-Гимзе или моноклональными антителами в тот же день или хранят не более недели при температуре (4 +/- 2) °С. Аналогичным образом готовят препараты из неинфицированных клеток.

Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения специфических включений хламидий или их антигенов в инфицированной культуре клеток. В препаратах из неинфицированной культуры клеток специфические включения хламидий или их антигены должны отсутствовать.

5.3. Для выделения хламидий на лабораторных животных заражают 5 белых мышей массой 16 — 20 г или 2 — 3 морских свинок массой 300 — 350 г.

Материал, подготовленный, как описано в пункте 5.1, вводят внутрибрюшинно или интраторакально (в грудную полость через межреберные ткани с правой стороны) белым мышам в дозе 0,3 куб. см, морским свинкам — 0,5 куб. см.

Животные находятся под наблюдением до 10 дней. При наличии в материале патогенных хламидий животные заболевают и через 7 — 10 дней после заражения погибают. При вскрытии павших животных обнаруживают значительное количество серозно-фибринозного экссудата в грудной и брюшной полостях, очаговую пневмонию, точечные кровоизлияния под легочной плеврой.

На 10 день после заражения (при отсутствии гибели) животных убивают и проводят следующий пассаж на этом же виде животных по общепринятой методике, используя для заражения центрифугат 10% суспензии из паренхиматозных органов.

Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения и идентификации хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в патологическом материале от животных, павших на 7 — 10 день после заражения, в любом из трех последовательных пассажей.

6. Выявление ДНК хламидий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

6.1. Метод предназначен для выявления ДНК Chlamydia с помощью ПЦР в патологическом материале от животных. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 95 °С, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре 62 °С и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента при температуре 72 °С.

6.2 В ПЦР используют следующие наборы:

• набор для выделения ДНК (набор № 1);
• набор для проведения ПЦР (набор № 2);
• набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор № 3);
• набор контрольных образцов (набор № 4).

6.2.1 Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:

• лизирующий раствор — 1 пробирка, 30 куб. см;
• отмывочный раствор № 1-1 пробирка, 20 куб. см;
• концентрат для отмывочного раствора № 2 -1 пробирка, 20 куб. см;
• суспензия сорбента — 2 пробирки по 2 куб. см;
• буфер для элюции ДНК с сорбента — 2 пробирки по 5 куб. см.

6.2.2 Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:

• смесь праймеров «Chla» — 1 пробирка, 0,25 куб. см;
• смесь нуклеотидов — 1 пробирка, 0,25 куб. см;
• 5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 0,5 куб. см;
• деионизованная вода — 1 пробирка, 1 куб. см;
• фермент Taq-полимераза — 1 пробирка, 0,05 куб. см;
• воск для ПЦР — 1 пробирка, 1,0 куб. см;
• масло минеральное — 1 пробирка, 5,0 куб. см.

6.2.3 Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:

• концентрат буфера с бромидом этидия — 3 флакона по 25 куб. см;
• агароза для электрофореза — 3 пробирки по 2 г.

6.2.4 Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:

• ОКО (отрицательный контрольный образец) — 1 пробирка, 1 куб. см;
• положительный контрольный образец для ПЦР- К+ ДНК (ДНК Chlamydia psittaci) — 1 пробирка, 0,1 куб. см.

6.3 Отбор материала для исследования.

6.3.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

6.3.2 Для исследования используют:

• паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта).

6.3.3. Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 куб. см, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3x3x3 куб. см (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).

6.3.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при минус 20 °С в течение 30 дней. Пробы мочи доставляют в тот же день.

6.4 Подготовка исследуемого материала.

6.4.1. Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипеточными дозаторами переменных объемов (типа «Ленпипет») с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 куб. см и 10,0 куб. см (ПО «Ленполимер») и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.

6.4.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 куб. см центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 — 15 мин. При необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 куб. см жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 куб. см материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся надосадочной жидкости (или физиологическом растворе) и 100 мкл его используют для выделения ДНК.

6.4.3. Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, размером 3x3x3 куб. мм помещают в пробирки типа «эппендорф», тщательно растирают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 куб. см физиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20 — 25 °С в течение 20 мин, после чего 100 мкл верхней фазы используют для выделения ДНК.

6.4.4. Сперму в объеме 0,5 куб. см разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 10000 — 12000 об./мин. в течение 8 — 10 мин., осадок ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения ДНК.

6.4.5. Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5 — 1,0 куб. см физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000 — 12000 об/мин в течение 8 — 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то пробу обрабатывают 1 — 2 куб. см раствора 0,1 М меркаптоэтанола, добавив его в «эппендорф». Размешивают на вортексе, выдерживают при комнатной температуре 3 — 5 мин. и центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения.

6.5 Проведение ПЦР-анализа.

6.5.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), для работы в которых дополнительно требуются следующие материалы и оборудование:

Для выделения ДНК из испытуемого материала — ЗОНА 1:

• настольный бокс с бактерицидной лампой;
• термостат для пробирок типа «эппендорф» на 25 — 100 °С;
• микроцентрифуга до 12000 — 16000 об/мин;
• центрифуга/вортекс «Микроспин»;
• отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 куб. см до 1 куб. см;
• одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;
• одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 куб. см типа «эппендорф»;
• штативы для пробирок, наконечников;
• отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
• холодильник на 2 — 8 °С с морозильной камерой.

Для проведения амплификации (ПЦР) — ЗОНА 2:

• отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 куб. см до 1 куб. см;

• камера для горизонтального электрофореза;
• источник постоянного тока на 150 — 200 В;
• ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;
• фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка;
• бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
• аквадистиллятор;

• колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
• электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.

6.5.2 Порядок работы.

ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.

Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью набора № 1. Предварительно готовят отмывочный раствор № 2, смешав в отдельном флаконе 20 куб. см концентрата из набора, 80 куб. см дистиллированной воды и 100 куб. см 96% этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при температуре 20 — 22 °С под плотно закрытой крышкой.

Проверяют состояние сорбента — при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии. После этого приступают к выделению ДНК.

В ряд полипропиленовых пробирок объемом 1,5 куб. см вносят по 100 мкл предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных проб 1-го этапа анализа («контролей выделения»): отрицательные пробы — элюирующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подготовки пробы с его использованием), положительная проба — ДНК Chlamydia (из набора № 4), разведенная 1:10 элюирующим буфером. Добавляют по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5 — 10 раз до полного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор. Прогревают пробирку 5 мин. при 65 °С, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения материала. Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое пробирки на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин. для осаждения сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 5 — 7 мин. Осаждают сорбент на «Микроспине» в течение 30 сек. и отбирают супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой — ловушкой для отбираемой жидкости). Добавляют по 200 мкл отмывочного раствора № 1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают при помощи наконечника пипетки), осаждают на «Микроспине» в течение 30 с и отбирают супернатант.

Добавляют по 800 мкл отмывочного раствора № 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10000 об./мин. в течение 30 с, отбирают супернатант. Повторяют процедуру отмывки раствором № 2, тщательно отбирают супернатант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате при 65 °С в течение 5 — 7 мин.

Добавляют 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в термостат при 65 °С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту. Осаждают на микроцентрифуге при 10000 об./мин. в течение минуты. Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.

Подготовить положительный контрольный образец для ПЦР, для чего развести К+ ДНК в 100 раз в буфере для элюции ДНК и вместе с ДНК-пробами перенести в комнату для постановки ПЦР.

ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).

Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного расплавления.

Готовят «нижнюю» реакционную смесь, используя стерильные наконечники

(полистирол выдерживает автоклавирование при 120 °С):

• для амплификации ДНК Chlamydia: к 0,25 куб. см праймеров «Chla» добавляют 0,25 куб. см нуклеотидов, смешивают на вортексе;

Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл «нижней» смеси, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки «Chla». Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в амплификаторе 5 мин. при 95 °С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в морозильнике несколько месяцев, можно приготовить сразу 50 — 100 штук.

Готовят «верхнюю» смесь: к 0,5 куб. см 5-кратного реакционного буфера добавляют 0,45 куб. см деионизованной воды и 0,05 куб. см Taq-полимеразы, хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2 — 8 °С в течение месяца (не замораживать!). Выставляют ряд пробирок с «нижними» смесями («Chla») в штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа («контроли выделения»), и добавляют пробирки для «контролей ПЦР» (деионизованная вода и ДНК Chlamydia, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их. Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл «верхней» смеси, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с «нижней» смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по 10 мкл проб — испытуемых и контрольных и 10 мкл К+ ДНК, подготовленной для постановки ПЦР, т.е. разведенной 1:100 буфером для элюции. Для отрицательного контроля амплификации вместо ДНК-пробы добавляют 10 мкл деионизованной воды (из набора № 2).

Набирают на амплификаторе нужную программу:

Амплификаторы с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения — не менее 1 °С/сек): «MiniCycler», «РТС-100» (MJ Research)		Амплификаторы с активным регулированием по раствору в пробирке): «GeneAmp PSR System 2400» (Perkin Elmer); «Omn-E» (Hibaid); «Терцик» (ДНК-технология)
95 °С — пауза 95 °С — 2 мин.	1 цикл	95 °С — пауза 95 °С — 2 мин.	1 цикл
95 °С — 45 с 62 °С — 45 с 72 °С — 45 с	40 циклов	95 °С — 10 с 62 °С — 10 с 72 °С — 10 с	40 циклов
10 °С — 12 — 14 час. (хранение)		10 °С — 12 — 14 час. (хранение)

ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.

Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре ПЦР помещении («Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 27 января 1997 г. № 13-7-2/840).

В мерный цилиндр наливают 25 куб. см концентрированного буфера, доводят дистиллированной водой до 500 куб. см, закрывают цилиндр парафинированной пленкой («PARAFILM») и перемешивают. Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 куб. см, наливают 100 куб. см готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин. и немного остужают, вращая колбу. Заливают агарозный гель в форму (толщина 5 — 6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

После полного застывания геля (30 мин. при комнатной температуре) осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл гель на 4 — 5 мм. Выставляют пробирки с продуктами амплификации последовательно в штатив. Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки. Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1 — 2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.

Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной).

Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа «Микрат 300» или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить с помощью других систем: Insta Doc I, Insta Doc II (фотографирующие), Gel Doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).

6.5.3 Учет и интерпретация результатов.

В дорожке, соответствующей положительному контрольному образцу должна быть яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 300 п.н. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне 300 п.н.

В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу, не должно быть каких-либо полос. Отрицательными считаются образцы, которые не содержат специфической полосы 300 п.н.

Кроме полосы 300 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п (в нижней части дорожки).

При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.

Результаты анализа не учитываются, если:

• в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина — ошибка на первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от ингибиторов реакции;
• в дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации.

Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы;

• в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях.

Возможные причины: неправильное проведение «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

7. Диагноз на хламидийные инфекции считают предварительным

8. Сроки исследований

С утверждением настоящих методических указаний утрачивают силу «Методические указания по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР от 15 апреля 1986 года.

---