Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями
(утв. Минсельхозпродом России 11.10.1999 № 13-7-2/1759)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563). Взамен «Методических указаний по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утв. ГУВ Минсельхозпрода СССР 12.11.1991.
Утверждаю Зам. руководителя Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ В. В. Селиверстов 11 октября 1999 г. № 13-7-2/1759
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ СМЕШАННОЙ КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИИ МОЛОДНЯКА ЖИВОТНЫХ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ПАТОГЕННЫМИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЯМИ
Методические указания разработаны Л.С. Кавруком, С.В. Бритовой, А.Б. Кононенко (ВНИИ ветсанитарии, гигиены и экологии), В.А. Седовым, Л.А. Тарановой (Центральная научно-методическая ветлаборатория Минсельхозпрода РФ).
С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу «Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденные ГУВ Министерства сельского хозяйства и продовольствия СССР 12 ноября 1991 г.
1. Общие положения
1.1. Смешанная кишечная инфекция — остропротекающая инфекционная болезнь молодняка разных видов сельскохозяйственных животных, которая имеет полиэтиологическую природу и вызывается двумя-тремя и более видами патогенных энтеробактерий, относящимся к родам Escherichia, Citrobacter, Proteus, Morganella, Klebsiella, Salmonella. Помимо указанных микроорганизмов возбудителями болезни могут быть также бактерии других родов и семейств — Yersinia, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium и пр. Наряду с бактериальными агентами нередко (особенно на крупных фермах) болезнь обусловливают корона- и ротавирусы.
1.2. Болезнь возникает в первые дни и недели жизни животных и проявляется чаще в виде энзоотической вспышки, развитию которой способствуют различные факторы, связанные с несоблюдением технологических и ветеринарно-санитарных требований воспроизводства стада, а также нарушением режимов содержания и кормления молодняка.
1.3. Смешанная кишечная инфекция может протекать в кишечной (энтеритной) и септической формах. При кишечной форме возбудители болезни локализуются только в желудочно-кишечном тракте и брыжеечных лимфоузлах, регионарных пораженным участкам кишечника; при септической форме — в паренхиматозных органах, различных тканях, а также в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. Основными клиническими признаками болезни являются: потеря аппетита, понос, переходящий в профузный, нарастающая слабость, депрессия, учащенное дыхание и сердцебиение, обезвоживание организма (при затяжном течении); нередко наблюдается поражение центральной нервной системы (возбуждение, судороги), иногда пневмония, артриты; температура тела в пределах нормы, в отдельных случаях повышена на 0,5 — 1 °C, в предагональном состоянии она снижается ниже нормы.
1.4. Патологоанатомические изменения у погибших животных имеют картину катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита, на слизистой желудка, тонкого отдела кишечника и слепой кишки могут встречаться язвы, нередко отмечаются множественные точечные, полосчатые и пятнистые кровоизлияния на слизистой желудка, толстого и тонкого отделов кишечника, под капсулой селезенки, эпи- и эндокарде (клапанах); иногда отмечается очаговая катаральная пневмония и отек легких, дистрофия печени; регионарные брыжеечные лимфатические узлы как правило увеличены, отечны, на разрезе розового или красно-вишневого цвета; при вскрытии черепной коробки — гиперемия кровеносных сосудов и отек ткани головного мозга. Указанные изменения могут быть в отдельных или одновременно в нескольких органах.
1.5. Диагноз на смешанную кишечную инфекцию в хозяйствах устанавливают на основании совокупности эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, массовость поражения, стационарность и др.), клинических признаков болезни, патологоанатомической картины и результатов бактериологического (при необходимости еще и вирусологического) исследования патологического материала от больных или погибших животных.
2. Отбор материала для исследования
2.1. Для посмертной бактериологической диагностики в лабораторию направляют 2 — 4 свежих трупа погибших или убитых с диагностической целью больных животных (желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами). В случае невозможности доставки целого трупа посылают следующий патологический материал: голову, трубчатую кость, сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты, селезенку, долю печени с желчным пузырем, брыжеечные лимфатические узлы, регионарные воспаленному участку кишечника, а также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой (в отдельной таре или полиэтиленовом пакете). Указанный патологический материал исследуют в день поступления его в лабораторию.
2.2. Для прижизненной бактериологической диагностики в лабораторию направляют фекалии больных диареей животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий берут от 5 — 6 больных животных одной фермы в стерильные пробирки по 2 — 3 г непосредственно из прямой кишки с помощью прокипяченного резинового катетера. Пробирки вместе с сопроводительной запиской упаковывают в полиэтиленовый пакет или картонную коробку.
При невозможности быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3 — 4 часа после взятия) их консервируют стерильным 30%-ным глицериновым раствором в соотношении 1:2 (см. приложение).
2.3. Пробы фекалий и содержимого тонкого отдела кишечника (в количестве не более 0,5 г) разводят в 10 см3 стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, тщательно размешивают и затем выдерживают 10 — 15 минут при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость используют для посева на питательные среды не позднее 1 — 2 часов после приготовления взвесей. При исследовании консервированных фекалий, их тщательно размешивают, после чего разводят физиологическим раствором в 5 — 10 раз.
3. Выделение культур энтеробактерий, изучение их морфологических, культуральных и ферментативных свойств
3.1. Патологический материал (за исключением содержимого тонкого отдела кишечника и фекалий) засевают в пробирки с МПБ и на плотные дифференциально-диагностические среды в чашках: Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар). Содержимое тонкого отдела кишечника и фекалий засевают только на указанные выше плотные среды в чашках. Кроме того для выделения из фекалий сальмонелл неразведенные пробы фекалий засевают еще в одну из сред обогащения (селенитовый бульон, магниевую, Мюллера или др.) в соотношении 1:5.
3.1.1. Посев материала в МПБ проводят пастеровской пипеткой. Посевы на плотные среды в чашках из внутренних органов и тканей, указанных в п. 2.3, делают путем отпечатков разрезанной поверхностью кусочка органа из предварительно профламбированного участка на подсушенную питательную среду или вносят материал пастеровской пипеткой на поверхность среды, а затем равномерно растирают его стеклянным шпателем.
3.1.2. Содержимое тонкого отдела кишечника, взятое путем соскоба с пораженного участка слизистой оболочки, суспендируют в 10 см3 стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, затем засевают суспензию бактериологической петлей на подсушенные в термостате плотные дифференциально-диагностические среды в чашках широким частым штрихом по всей поверхности среды. Аналогичным образом проводят посев разведенных фекалий.
3.2. Пробирки с посевами в МПБ из внутренних органов и тканей инкубируют при температуре 37 — 38 °C в течение 18 — 24 часов. При наличии в МПБ помутнения среды культуру микроскопируют и в случае обнаружения мелких грамотрицательных палочек пересевают ее на агар Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар) в чашках, которые помещают в термостат (37 — 38 °C) на 18 — 24 часа.
Пересев культур, полученных в МПБ, на плотные селективные среды проводят в том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из соответствующих органов и тканей.
3.3. Чашки с посевами на агаре Эндо (или Левина) из внутренних органов, тканей или фекалий инкубируют при температуре 37 — 38 °C в течение 18 — 24 часов. После просмотра культур пересевают колонии лактозоположительных бактерий (круглые, средних размеров S-формы, красно-малинового цвета на агаре Эндо и темно-фиолетового цвета на агаре Левина с наличием или отсутствием металлического блеска) в чашки с МПА и средой Минка в соответствии с рекомендациями, изложенными в действующих «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных».
При наличии на агаре Эндо (или Левина) роящегося налета, характерного для протея, пересевают его на скошенный МПА (культуры из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий). Чашки и пробирки с посевами инкубируют 18 — 20 часов при той же температуре.
СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА СМЕШАННУЮ КИШЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ
3.4. Чашки с первичными посевами на агаре Плоскирева инкубируют при температуре 37 — 38 °C в течение 24 — 36 часов. После просмотра культур пересевают мелкие круглые колонии S-формы полупрозрачные, сероватого цвета с голубым оттенком в пробирки со скошенным МПА (по 1 — 2 колонии с культур из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий, каждую колонию в отдельную пробирку), которые помещают в термостат на 18 — 24 часа.
В том случае, если пересев проводят на комбинированную среду (Олькеницкого, Клиглера), то каждую колонию пересевают в одну пробирку с этой средой и в одну пробирку со скошенным МПА.
3.5. Суточные культуры бактерий на скошенном МПА или комбинированной среде, выделенные из внутренних органов, тканей или фекалий, микроскопируют (окраска по Граму) и при наличии в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул (бактерии вида Klebsiella pneumoniae образуют капсулу), используют для изучения ферментативных, патогенных, антигенных свойств, а также (при необходимости) определения подвижности в полужидком МПА. Для выявления у культур клебсиелл капсулы окраску мазков проводят по методу Гинса (тушью).
3.6. Ферментативные свойства изучают у 2 — 6 агаровых (в порядке исключения у бульонных) культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на наборе сред с углеводами и индикатором Андреде или полужидких средах с индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на средах с мочевиной, сернокислым железом (определение сероводорода), агаре Симонса, в бульоне Хоттингера или МПБ (определение индола), мясопептонной желатине, среде с фенилаланином.
При использовании комбинированной среды Олькеницкого или Клиглера учитывают изменения, вызываемые представителями разных родов энтеробактерий в этой среде, после чего данную культуру изучают по другим необходимым биохимическим тестам.
Засеянные пробирки инкубируют при температуре 37 — 38 °C.
Предварительные результаты изучения ферментативных свойств культур учитывают через 24 часа, окончательные результаты — через 48 часов. Изучение ферментативных свойств культур энтеробактерий можно проводить также с помощью тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий. Родовую и видовую принадлежность культур устанавливают по показателям таблицы.
Следует учитывать, что у бактерий рода Proteus встречаются нероящиеся штаммы, образующие при росте на плотных питательных средах мелкие круглые колонии S-формы сероватого цвета. Важными признаками родовой идентификации таких штаммов является их способность дезаминировать фенилаланин и разжижать желатин.
При наличии у культур отклонений от основных показателей таблицы используют дополнительные тесты: реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, наличия образования оксидазы, определение подвижности и др.
Дифференциальные признаки энтеробактерий по ферментативным свойствам
Обозначения: «+» — ферментация сахара (КГ), образование индола, расщепление мочевины и т.д.
«-» — отсутствие ферментации сахара, образования индола, расщепления мочевины и т.д.
«(-)» — отдельные штаммы не вызывают ферментации сахара, образования индола и т.д.
«(+)» — замедленное разжижение желатины
4. Серологическая идентификация культур бактерий
4.1. Серологическую идентификацию культур эшерихий и сальмонелл проводят в соответствии с действующими «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» и «Методическими указаниями по лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных, обнаружению сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды».
Культуры названных бактерий относят к возбудителям болезни на основании показателей, указанных в этих методических указаниях.
4.2. Для серотипирования культур морганелл, выделенных из патологического материала, применяют набор нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых сывороток. Серологическую типизацию культур осуществляют в соответствии с наставлением по применению указанных сывороток, утвержденным Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 28.04.1997 г. При выделении культур морганелл патогенной серологической группы их относят к возбудителям болезни и у таких культур патогенные свойства в биопробе на белых мышах не определяют.
4.3. Ускоренное обнаружение эпизоотических штаммов морганелл в первичных смешанных культурах, полученных после посева патологического материала на среду Плоскирева, с одновременной серологической типизацией их осуществляют в реакции нейтрализации антител (РНАт) в соответствии с «Методическими указаниями по ускоренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в реакции нейтрализации антител», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 24.03.1999 г. Для постановки РНАт применяют набор агглютинирующих морганеллезных серогрупповых сывороток, указанный в п. 4.2, и набор морганеллезных эритроцитарных диагностикумов, которые используют в соответствии с «Наставлением по применению набора диагностикумов морганеллезных эритроцитарных», утвержденному Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 24.03.1999 г. При обнаружении в реакции нейтрализации антител эпизоотических штаммов морганелл серогрупп O1, O16, O26, O29, O33, O45, O49, «13» выделение чистых культур данных бактерий и изучение их морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств не проводят.
5. Определение патогенных свойств культур бактерий
5.1. Патогенные свойства определяют у культур бактерий, относящихся к родам Proteus, Citrobacter, Klebsiella, а также родам Escherichia и Morganella, не имеющих адгезивные антигены и не типируемых по О-антигену, в биопробе на белых мышах.
5.2. Для определения патогенных свойств бактерий используют агаровые культуры вышеуказанных микроорганизмов, выделенные из двух внутренних органов и тканей погибших или фекалий больных животных. С каждой из двух культур одного вида бактерий готовят смывы стерильным физиологическим раствором, устанавливают взвесь бактерий в концентрации 1 млрд микробных клеток/см3 (10 единиц по оптическому стандарту мутности), после чего их смешивают в равной пропорции.
5.3. Взвесями культур каждого вида бактерий заражают по три белые мыши массой 14 — 15 г внутрибрюшинно в дозе 0,5 млрд микробных клеток. Культуру признают патогенной в случае гибели двух и более мышей в течение трех суток после заражения и относят ее к возбудителю болезни.
5.4. При выделении культур энтеробактерий, относящихся к одному виду того или иного рода, указанного в п. 1.1, из селезенки, крови сердца, костного, головного мозга (не менее, чем из двух перечисленных органов и тканей) свежего трупа животного патогенные свойства этих культур в биопробе на белых мышах не определяют и их серологическую типизацию не проводят; такие культуры относят к возбудителю болезни.
6. Учет результатов бактериологического исследования
6.1. Бактериологический диагноз на смешанную кишечную инфекцию молодняка сельскохозяйственных животных устанавливают на основании выделения из патологического материала культур, принадлежащим к двум и более родам энтеробактерий, указанных в п. 1.1, и относящихся к возбудителям болезни по одному из показателей, изложенных в п.п. 4.1, 4.2, 5.3, 5.4.
6.2. Результаты бактериологического исследования формулируют: «Из присланного патологического материала (указать какого) выделены возбудители смешанной кишечной инфекции (указать какие виды бактерий, типы адгезивных антигенов у энтеропатогенных эшерихий, серогруппу в случае серотипирования культур эшерихий и морганелл)».
6.3. При необходимости определяют антибиотикочувствительность каждого вида выделенной культуры возбудителя кишечной инфекции в соответствии с действующими «Методическими указанию по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных».
6.4. Общий срок бактериологического исследования патологического материала до 7 суток.
РЕЦЕПТЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РЕАКТИВОВ, ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ
1. Глицериновый раствор для консервирования фекалий
| Состав: | Глицерин нейтральный | - 300 см3 |
| Натрий хлористый | - 5 г | |
| Вода дистиллированная | - 700 см3 |
Раствор стерилизуют при 1 атм (121 °C) в течение 20 мин или прогревают в водяной бане (100 °C) в течение 30 — 40 мин.
2. Среда с мочевиной (по Преусу)
| Состав: | Бульон Хоттингера или мартеновский бульон | - 1000 см3 |
| Агар-агар | - 15 г | |
| Глюкоза | - 5 г | |
| 50% водный раствор мочевины | - 20 см3 | |
| 0,2% раствор бромтимолблау | - 12 см3 |
Приготовление: к стерильному расплавленному агару на бульоне Хоттингера или мартеновском бульоне с pH 6,9 — 7,0 добавляют глюкозу, растворы мочевины и индикатора бромтимолблау. Расплавленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 см3 и стерилизуют однократно текучим паром 20 мин. Перед употреблением среду скашивают. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет.
При расщеплении мочевины среда приобретает синий цвет, при отсутствии расщепления мочевины она окрашивается в желтый цвет.
Для определения способности бактерий усваивать цитратно-аммонийные соли используют коммерческую сухую среду, которую готовят согласно указаниям на этикетке препарата, или агар Симонса, приготовленный на основе жидкой среды Козера.
Для приготовления агара Симонса к 1 дм3 среды Козера добавляют 20 г агар-агара и 10 см3 индикатора бромтимолблау. Последний готовят из расчета: бромтимолблау 1 г; 0,1 № раствор NaOH — 25 см3 (для получения указанного раствора к 100 см3 дистиллированной воды добавляют 0,4 г NaOH), дистиллированная вода — 475 см3.
Среду нагревают до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет. Перед употреблением среду скашивают.
Бактерии, способные усваивать цитратно-аммонийные соли, дают рост на агаре Симонса с изменением его в синий цвет. При отсутствии указанного свойства роста культуры не происходит и цвет среды не изменяется.
4. Среда для определения сероводорода
К 1 дм3 расплавленного стерильного 1,7%-ного МПА добавляют 0,2 г сернокислого железа (FeSO4 x 7H2O), 0,3 г серноватистокислого натрия-тиосульфата (Na2S2O3 x 5H2O), 1 г лактозы, 12 см3 0,2% водного раствора фенолрота. После размешивания компонентов среду разливают в стерильные пробирки по 6 — 7 см3 и стерилизуют текучим паром в течение 20 мин. Готовая среда имеет бордово-красный цвет. Перед употреблением среду скашивают так, чтобы она имела столбик размером 2,5 — 3 см.
Среду засевают агаровой культурой бактерий вначале на скошенную поверхность, а затем уколом в столбик. В случае образования сероводорода среда в столбике окрашивается в черный цвет. При отрицательном результате почернения среды не наступает.
5. Реактивы для обнаружения индола
5.1 Реактив Эрлиха
| Состав: | Пара-диметиламинобензальдегид | - 1 г |
| Спирт этиловый 96° | - 95 см3 | |
| Соляная кислота концентрированная | - 20 см3 |
Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту; хранят реактив в закрытом темном флаконе.
5.2 Реактив Ковача
| Состав: | Пара-диметиламинобензальдегид | - 5 г |
| Спирт амиловый | - 75 см3 | |
| Соляная кислота концентрированная | - 25 см3 |
Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте при нагревании в водяной бане (50 — 55 °C), после остывания смеси добавляют кислоту; хранят реактив при температуре 4 — 6 °C.
Применение реактивов: к двухсуточной культуре бактерий в бульоне Хоттингера добавляют 0,5 см3 реактива Эрлиха или Ковача, пробирки встряхивают и через 1 — 2 мин учитывают результаты. В случае образования индола верхний слой жидкости приобретает красно-малиновый цвет, при отрицательной реакции он окрашивается в желтый цвет.
5.3 Индикаторные бумажки для определения индола
Предварительно готовят следующий реактив:
| Пара-диметиламинобензальдегид | - 5 г |
|---|---|
| Ортофосфорная кислота концентрированная (H3PO4) | - 10 см3 |
| Спирт этиловый 96° | - 50 см3 |
Полученный реактив переливают в эмалированный металлический кювет, в который помещают кусочки фильтровальной бумаги. Смоченные реактивом бумажки высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем нарезают полосками размером 0,7 — 0,8 x 10 — 12 см. Бумажки имеют желтый цвет. Хранят их в банке из темного стекла, закрытой резиновой или корковой пробкой.
Для приготовления индикаторных бумажек можно использовать реактив Эрлиха или Ковача.
Применение: после посева изучаемой культуры бактерий в бульон Хоттингера или МПБ помещают в пробирку полоску индикаторной бумажки, верхний конец которой прижимают ватной пробкой. Нижний конец бумажки должен быть на расстоянии не менее 2 — 3 см от поверхности среды. Засеянные пробирки инкубируют в термостате в течение двух суток. При наличии индолообразования нижний конец индикаторной бумажки окрашивается в красно-малиновый цвет, при отрицательной реакции цвет бумажки не изменяется.
Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин используют коммерческую сухую среду, которую готовят по прописи, указанной на этикетке, или среду приготовленную по следующему рецепту:
Компоненты растворяют в воде при нагревании, pH не устанавливают, среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 3 — 4 см3 и стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают.
Применение: к одно-двухсуточной культуре на среде с фенилаланином в наклонном положении добавляют 10 — 12 капель 10% раствора хлорного железа (FeCl3 x 6H2O). При положительной реакции через 2 — 3 мин культура окрашивается в зелено-синий или зеленовато-голубой цвет, при отрицательной реакции цвет культуры не изменяется.
7. Среда Кларка для реакций с метилротом и Фогес-Проскауэра
| Состав: | Пептон ферментативный | - 5 г |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный (K2HPO4 x 3H2O) | - 5 г | |
| Глюкоза | - 5 г | |
| Вода дистиллированная | - 1000 см3 |
Приготовление: после растворения компонентов в воде устанавливают pH среды 6,9 — 7,0, затем кипятят ее 2 — 3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин.
Применение: для постановки реакции с метилротом из пробирки с двухсуточной культурой бактерий в среде Кларка отсасывают в чистую сухую пробирку 2,5 см3 жидкости, добавляют к ней 8 — 10 капель индикатора метилрота, пробирку встряхивают, после чего учитывают реакцию. Изменение цвета культуры зависит от величины pH: розовое окрашивание (при pH ниже 5,0) означает положительную реакцию, желтое окрашивание (при pH выше 6,0) — отрицательную реакцию, светло-оранжевое окрашивание (при pH 5,0 — 6,0) — сомнительную реакцию.
| Метиловый красный | - 0,01 г |
|---|---|
| Спирт этиловый 96° | - 30 см3 |
| Вода дистиллированная | - 20 см3 |
Приготовление: навеску краски растворяют в спирте, затем добавляют воду и смесь размешивают. Хранят индикатор в темном месте под притертой пробкой.
Для постановки реакции Фогес-Проскауэра к 2,5 см3 культуры бактерий добавляют вначале 1 см3 6%-ного спиртового раствора \alpha - \text{нафтола} , а затем 0,4 см3 40%-ного водного раствора KOH, пробирку тщательно встряхивают и спустя 3 — 5 мин учитывают результаты. При наличии в культуре ацетилметилкарбинола она окрашивается в розовый цвет — положительная реакция, окраска культуры в желтый цвет свидетельствует об отрицательной реакции, при сомнительной реакции культура окрашивается в светло-оранжевый цвет.
Состав реактивов для реакции Фогес-Проскауэра:
| а) | \alpha - \text{нафтол} (C10H8O) | - 30 г |
| Спирт этиловый 96° | - 500 см3 | |
| б) | Калий гидроокись (KOH) | - 120 г |
| Вода дистиллированная | - 300 см3 |
8. Среды для предварительной идентификации культур лактозоотрицательных бактерий
8.1 Среда Олькеницкого
Приготовление: компоненты растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды нагретой до температуры 45 — 50 °C; сухой питательный агар расплавляют в отдельной посуде в остальной части дистиллированной воды при нагревании, затем смешивают растворы солей и расплавленного агара, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 — 7,4, после чего добавляют раствор индикатора и тщательно размешивают его; готовую среду разливают в пробирки по 6 — 7 см3 и стерилизуют текучим паром дробно в течение трех суток ежедневно по 20 мин. Стерильную среду скашивают таким образом, чтобы столбик был не менее 2 — 2,5 см. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.
Применение: для посева используют агаровую культуру бактерий, которую засевают бактериологической петлей вначале на поверхность скошенной части среды (косяка), затем уколом в столбик. Засеянные пробирки инкубируют при 37 — 38 °C в течение 24 — 48 часов.
В культурах, ферментирующих только глюкозу, столбик окрашивается в желтый цвет, косяк имеет розовый цвет. В культурах, ферментирующих глюкозу, а также лактозу и сахарозу или только один из последних двух сахаров, столбик и косяк окрашиваются в желтый цвет. Культуры, расщепляющие мочевину, окрашивают столбик и косяк в красный цвет; при образовании сероводорода столбик (или часть его) приобретает черный цвет. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрывов в столбике среды.
Агар Клиглера готовят из сухой коммерческой среды согласно рецепту, указанному на этикетке.
При отсутствии готовой среды ее приготовляют по следующему рецепту:
Порядок и последовательность растворения компонентов среды, величина pH, объем готовой среды в пробирках и режим стерилизации такие же, как и при приготовлении среды Олькеницкого. Готовая среда имеет буровато-красный или оранжево-красный цвет.
Применение: условия посева культур бактерий, время инкубирования пробирок и характер изменений в столбике и на косяке среды аналогичны тем, которые наступают в среде Олькеницкого.