Методические указания по лабораторным исследованиям на трипаносомозы лошадей, верблюдов, ослов, мулов и собак

(утв. Минсельхозпродом России 06.09.1994 № 13-7-2/150)

(ред. от 27.01.1997)

Утверждаю Заместитель начальника

1. Общие положения

1.3 В лаборатории для исследования направляют:

Соскобы из различных мест слизистой оболочки уретры берут с помощью уретральной ложки. Для этого жеребца фиксируют и вводят внутримышечно в области крупа рометар в дозе 7,5 куб. см на 100 кг массы тела. Через 7 — 10 мин. вводят уретральную ложку на глубину 5 — 6 см и делает 3 — 4 возвратно-поступательных движения по стенке уретра. После чего уретральную ложку осторожно извлекают, опускают материал в пробирку физиологического раствора pH 7,0 — 7,2 и закрывают резиновой пробкой.

Сперму от жеребцов получают на искусственную вагину, переливают в стерильные пробирки по 2 куб. см и закрывают пробками.

(абзац введен дополнениями и изменениями, утв. Минсельхозпродом России 27.01.1997 № 13-7-2/838)

2. Микроскопическое исследование

2.1. При исследовании на месте каплю крови периферических сосудов наносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют в раздавленной капле под средним увеличением микроскопа в затемненном поле зрения.

Пробирки с соскобами, экссудатом и спермой помещают в термостат при 37 °C на 15 — 20 мин. Затем берут 3 — 4 капли из разных слоев содержимого пробирки и готовят препараты, как указано выше.

(в ред. дополнений и изменений, утв. Минсельхозпродом России 27.01.1997 № 13-7-2/838)

При микроскопии обнаруживают живых трипаносом по колебанию ундулирующей мембраны.

2.2. Из доставленных соскобов, экссудата, спермы, каждого органа делают по 2 тонких мазка и высушивают на воздухе.

(в ред. дополнений и изменений, утв. Минсельхозпродом России 27.01.1997 № 13-7-2/838)

Мазки крови периферических сосудов, из внутренних органов, соскобов, экссудата и спермы фиксируют этиловым ректификованным спиртом массовой долей 96% в течение 20 — 25 мин., окрашивают по Романовскому 30 — 50 мин. (краску Гимза используют в разведении 1:20), промывают дистиллированной или водопроводной водой pH 7,0 — 7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа.

(в ред. дополнений и изменений, утв. Минсельхозпродом России 27.01.1997 № 13-7-2/838)

При микроскопии необходимо учитывать, что трипаносомы, вызывающие су-ауру и случную болезнь, морфологически не дифференцируются, имеют веретенообразную форму, заостренную с переднего и слегка округленную с заднего конца. Цитоплазма трипаносом окрашивается в синевато-фиолетовый цвет, ядро — в красный, кинетопласт и жгутик — в розовый (интенсивность окрашивания зависит от времени окраски, качества краски).

3. Биологическое исследование

3.1. Заражение лабораторных животных проводят в случае получения отрицательных результатов микроскопического исследования на су-ауру и наличии клинических признаков у больного животного, а также при необходимости дифференциации су-ауру от лучной болезни.

3.2. Для заражения используют нативную, консервированную кровь или суспензию из паренхиматозных органов.

Кусочки органов массой 1,0 — 1,5 г измельчают и тщательно растирают в стерильной ступке с 1 — 2 куб. см физиологического раствора. Для заражения суспензию разводят стерильным физиологическим раствором pH 7,0 — 7,2 в соотношении 1:10.

3.3. Консервированную или нативную кровь вводят подкожно в области спины или внутриутробно в нижней трети живота, суспензию из паренхиматозных органов — подкожно в дозе 0,4 куб. см 3 белым мышам массой 12 — 15 г.

3.4 Наблюдение за зараженными белыми мышами ведут в течение 10 дней.

3.5. Гибель белых мышей наступает через 3 — 4 дня. Из паренхиматозных органов павших животных делают тонкие мазки, окрашивают, как указано в п. 2.2, и исследуют на наличие возбудителя су-ауру, так как возбудитель случной болезни в организме белой мыши не размножается.

При отсутствии гибели зараженных животных в указанные сроки от них, начиная с 5 дней после заражения, ежедневно исследует кровь, взятую из хвостовой вены, на наличие возбудителя су-ауру в раздавленной капле или окрашенном препарате.

4. Серологическое исследование

4.1. Исследование сывороток крови лошадей, ослов, мулов и собак проводят в реакции связывания комплемента (РСК), верблюдов — в формалиновой реакции (ФР).

4.2 Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

4.2.1 Компоненты реакции и подготовка их к работе.

Компоненты реакции:

• антиген трипаносомный жидкий или лиофилизированный, используют в рабочем разведении, указанном на этикетке;
• комплемент — нативная, консервированная или сухая (изготовленная на биофабрике) сыворотка крови морской свинки. При использовании сухого комплемента содержимое необходимого количества ампул растворяют в физиологическом растворе и сливают в одну пробирку. Полученный раствор комплемента используют для титрования (в разведении 1:20) и главного опыта;
• гемолитическая сыворотка (гемолизин) с титром не ниже 1:1000, которую используют в реакцию в удвоенном титре. Например, при титре гемолизина 1:1000 его берут в реакцию в разведении 1:500. Гемолизин титруют 1 раз в 3 мес. по общепринятой схеме: испытуемая, трипаносомная и нормальная сыворотки, разведенные для главного опыта и титрования комплемента, инактивируют при 60 — 62 гр. C (сыворотки ослов, мулов — при 64 — 65 гр. C) — 30 мин.;
• 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана, отмытых физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500 — 3000 об./мин. в течение 10 — 15 мин. до полной прозрачности надосадочной жидкости.

Перед постановкой реакции готовят разведение каждого компонента в соответствии с указаниями на этикетках и в количестве, необходимом для всего опыта, включая титрование. В процессе работы не допускается дополнительно разводить компоненты, смешивать их с ранее разведенными и использовать в реакции без титрования.

Физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде pH 7,0 — 7,2 готовят в день постановки реакции и кипятят в течение 5 мин.

Гемолитическую систему готовят путем смешивания равных объемов 2,5%-ной взвеси эритроцитов и гемолизина в удвоенном титре, выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20 — 30 мин.

4.2.2. Титрование комплемента в гемолитической системе проводят при получении каждой новой серии сухого комплемента или при использовании нативной сыворотки крови морской свинки.

Таблица 1

Компоненты реакции	Ряды Пробирок	Номера пробирок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Инактивированная негативная сыворотка 1:5	Первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	Второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент в разведении 1:20	Первый	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
	Второй	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Физиологический раствор	Первый	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
	Второй	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Антиген в рабочем разведении	Первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	Второй	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Физиологический раствор	Первый	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	Второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяная баня 20 мин. при 37 — 38 °C.

Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное количество его, вызывающего полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также с трипаносомной сывороткой без антигена, при полной задержке гемолиза в пробирках с трипаносомной сывороткой и антигеном (в таблице 1 титр равен 0,12).

Для главного опыта берут дозу комплемента, полученную при титровании.

4.2.4 Общее количество комплемента для главного опыта определяют по формуле:

X = \frac{\text{Т}*\text{П}}{20} ,

где:

Х — количество комплемента для главного опыта;

Т — титр комплемента в бактериологической системе;

П — количество пробирок в опыте;

20 — разведение комплемента при титровании.

Например, в опыте 100 пробирок, титр комплемента 0,12, расчет его на опыт:

\frac{0,12*100}{20} = 0,6\text{куб}.\text{см}.

Необходимое количество разведенного комплемента для реакции равно 20 куб. см (0,2 x 100), следовательно, к 0,6 куб. см основного разведения комплемента нужно добавить 19,4 куб. см физиологического раствора.

4.2.5 Постановка главного опыта.

Реакцию ставят в объеме 1,0 куб. см по 0,2 куб. см каждого компонента.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Для этого в первую пробирку вносят 0,1 куб. см сыворотки и добавляют 0,4 куб. см физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки переносят 0,2 куб. см во вторую и 0,1 куб. см — в третью, куда добавляют 0,1 куб. см физиологического раствора (разведение 1:10) и инактивируют, как указано в п. 4.2.1.

Титрование комплемента в бактериологической системе (на примере негативной сыворотки)

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,2 куб. см трипаносомного антигена в рабочем разведении, в пробирки первого ряда — по 0,2 куб. см физиологического раствора, во все пробирки — по 0,2 куб. см комплемента в установленном титре.

Реакцию помещают в водяную баню на 20 мин при 37 — 38 гр. C, затем в каждую пробирку вносят по 0,4 куб. см гемолитической системы и вновь выдерживают в бане при том же режиме.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в одной пробирке с разведением сыворотки 1:5, для чего с 0,05 куб. см сыворотки аппаратом Флоринского вносят 0,2 куб. см физиологического раствора. Все сыворотки, давшие положительный или сомнительный результат, подлежат переисследованию в 3 пробирках, как указано выше.

4.2.6 Контроли главного опыта:

позитивная сыворотка в разведениях от 1:5 до ее предельного титра с антигеном и в разведении 1:5 без антигена, негативная — в тех же разведениях, что и испытуемые;

антиген в двойной дозе без сыворотки (на антикомплементарность);

антиген в двойной дозе без сыворотки и комплемента (на гемотоксичность).

4.2.7 Учет и оценка результатов реакции.

в пробирках с положительной сывороткой и антигеном в контроле на гемотоксичность должна быть полная задержка гемолиза;

в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без антигена, с позитивной сывороткой без антигена и в контроле на антикомплементарность — полный гемолиз.

+ + — гемолиз 50% эритроцитов;

+ — гемолиз 75% эритроцитов;

• - полный гемолиз эритроцитов.

Положительной считают реакцию с оценкой на 2 — 4 креста в разведении 1:5 или 1 — 4 креста в разведении 1:10.

Сомнительной — 1 крест в разведении 1:5.

Отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в обоих разведениях сыворотки.

4.2.8. Животных, с сывороткой крови которых получены сомнительные результаты в РСК, исследуют повторно через 1 месяц. При получении вторично сомнительных результатов животных считают положительно реагирующими.

4.3 Постановка формалиновой реакции.

4.3.3. Постановка реакции. В чистую сухую пробирку вносят 1 куб. см сыворотки и 2 капли формалина, встряхивают, закрывают ватной пробкой и выдерживают 2 дня при комнатной температуре.

4.4.4 Учет и оценка результатов реакции:

положительная — сыворотка становится плотной, иногда мутнеет при опрокидывании пробирки не стекает;

сомнительная — сыворотка слегка густеет, стекает с трудом;

отрицательная — сыворотка остается без изменений.

5. Диагноз считают установленным при получении одного из следующих показателей

обнаружение трипаносом в мазках из исходного материала или от зараженных животных;

положительный результат серологического исследования;

положительная формалиновая реакция при наличии клинических или эксзоотологических данных.

6. Сроки исследований

---