Методические указания по диагностике акарапидоза и экзоакарапидоза пчел

(утв. Минсельхозом России 13.06.2002 № 13-5-02/0466)

13 июня 2002 г. № 13-5-02/0466

ПО ДИАГНОСТИКЕ АКАРАПИДОЗА И ЭКЗОАКАРАПИДОЗА ПЧЕЛ

Указания переработаны и дополнены научными сотрудниками ВИЭВ, ТГСХА, ВНИИВЭА, ВНИИВЭА, СЗЛ ВГНКИ, г. Курган совместно с научными сотрудниками ВНИИВСГЭ. Они утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 13 июня 2002 г. (N 13-5-02/0466).

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу на территории Российской Федерации «Методические указания по диагностике наружных клещей Акарапис на пчелах», утвержденные ГУВ МСХ СССР 05.07.1983, и «Методические указания по диагностике акарапидоза пчел», утвержденные ГУВ МСХ СССР 20.04.1984.

1. Общие сведения

1.1. Клещи рода Акарапис паразитируют на взрослых медоносных пчелах. На поверхности тела насекомых находят наружного клеща (Acarapis externus), спинного клеща (A. dorsalis) — возбудителей экзоакарапидоза пчел, а в их трахеях — A. woodi — возбудителя карантинного заболевания пчел — акарапидоза.

Клещи Acarapis externus и A. dorsalis вызывают беспокойство и гибель зараженных пчел в период зимовки. При массовой заклещеванности пчел в семье возможен частичный или полный распад клуба и образование большого количества подмора. В активный пчеловодный сезон насекомые теряют способность к полету. При поражении пчел трахейным клещом A. woodi признаки болезни нетипичны. У насекомых появляется понос, они теряют способность к полету, когда одно или оба задних крыла меняют свое типичное положение, располагаясь под разными углами, вплоть до перпендикулярного к оси их тела (феномен «К-крыло»). В зимний период происходит ослабление больных семей с последующей их гибелью весной или ранним летом.

Возможно одновременное поражение пчел всеми указанными видами клещей рода Акарапис.

1.2. Для исследования направляют не менее 50 внутриульевых живых пчел или такое же количество трупов свежего подмора. При массовом обследовании пчел на пораженность их A. woodi методом гомогенизации проба должна содержать около 200 пчел из семьи.

1.3. Живых пчел перед обследованием убивают этиловым эфиром или замораживают при -20 °C.

2. Порядок исследования

2.1. В лаборатории возбудителей экзоакарапидоза обнаруживают в смывах и при осмотре тела пчел.

2.1.1. Пчел помещают во флакон или пробирку, заливают жидкостью Удемана (87 частей 70%-ного этилового спирта, 5 частей глицерина, 8 частей ледяной уксусной кислоты), 70%-ным этиловым спиртом с 5% глицерина или водной эмульсией стирального порошка (по объему на каждые 20 частей дистиллированной воды используют 1 часть стирального порошка) и встряхивают в течение 10 — 15 минут. Через сутки встряхивание повторяют, пчел удаляют пинцетом, жидкость центрифугируют при 2000 оборотах в минуту в течение 10 минут и сливают. Осадок исследуют под микроскопом в затененном поле зрения с целью обнаружения клещей.

2.1.2. На пчелах клещей можно найти под бинокулярной лупой МБС-1 или МБС-2. Паразитов снимают тонкой препаровальной иглой.

2.2. Для обнаружения A. woodi применяют индивидуальное вскрытие пчел пробы, а при проведении массовых исследований — одновременное исследование всех пчел из пробы.

2.2.1. При индивидуальном исследовании пчелу кладут на спину и делают один поперечный разрез грудки сзади передней пары ног, удаляют у нее голову и второй разрез впереди средней пары ног и передних крыльев. Вырезанные сегменты тела, содержащие первую пару дыхалец и трахеи, для удаления мышечной ткани помещают в 8 — 10%-ный раствор KOH (NaOH), слегка нагревают в течение 20 минут и оставляют в растворе на ночь при комнатной температуре, после чего промывают и просматривают под увеличением x8 — 20. Мелкие овальные тела клещей видны через прозрачные стенки трахей. Наличие желтых, коричневых или черных пятен на стенках трахей подтверждают положительный диагноз на акарапидоз.

2.2.1.1. Для детального изучения структур тела клеща изолированные трахеи переносят на другое предметное стекло в каплю глицерина или дистиллированной воды и микроскопируют под большим увеличением (x100, x400) в затененном поле зрения.

2.2.1.2. Для контрастирования деталей строения тела паразитов в трахеях срезы грудки (см. п. 2.2.1) толщиной 1 — 1,5 мм помещают в 8 — 10%-ный раствор KOH (NaOH) и нагревают почти до кипения, выдерживая в нем в течение 10 минут. Содержимое выливают на фильтр, промывают водопроводной водой, окрашивают в течение 5 минут 1%-ным водным раствором метиленового синего (сначала готовят раствор указанной концентрации и к нему добавляют хлористый натрий в таком количестве, чтобы его концентрация составляла 0,85%), выдерживают в дистиллированной воде 2 — 5 минут, прополаскивают 70%-ным этанолом и микроскопируют. На светло-голубом фоне трахеи видны темно-синие клещи.

2.2.1.3. Для дифференциации живых и мертвых клещей выделенные без предварительной обработки щелочью трахеи пчел помещают в каплю красителя (5 мг тиазол голубой тетразолин в 5 мл дистиллированной воды) на предметном стекле, накрывают, слегка придавливая покровное стекло, чтобы удалить воздух, и микроскопируют. В течение нескольких секунд живые клещи окрашиваются в пурпурный, а погибшие — в зеленовато-желтый цвет.

2.2.2. При проведении массовых исследований пчел используют метод гомогенизации материала или компрессорный метод.

2.2.2.1. Перед гомогенизацией у пчел удаляют голову, крылья, ноги и брюшко. Оставшиеся грудки насекомых помещают в стакан объемом 100 мл, заливая в него на 1/4 объема дистиллированную воду. Гомогенизируют три раза по несколько секунд при 1000 оборотов в минуту. Суспензию пропускают через сито отверстием 0,8 мм, ополаскивают водой, доводя окончательный объем жидкости до 50 мл. Фильтрат центрифугируют при 1500 оборотов 5 минут, надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют несколько капель молочной кислоты, оставляя ее на 10 минут, а затем микроскопируют. У обнаруженных клещей определяют видовую принадлежность.

2.2.2.2. При компрессорном методе у пчел удаляют голову, крылья, ноги и брюшко. Грудки насекомых помещают в пробирки с 8 — 10%-ным раствором щелочи (KOH или NaOH), выдерживая их при комнатной температуре в течение суток, затем промывают водопроводной водой и просушивают на фильтровальной бумаге. Положив грудку пчелы на спинную сторону, захватывают ее анатомическим пинцетом с боков и переносят на компрессорий. В каждую клеточку компрессория выдавливают содержимое грудки одной пчелы, и скальпелем слегка счищают возможные остатки трахей с места выхода содержимого. После заправки клеточек накладывают второе стекло, компрессорий свинчивают и просматривают под малым увеличением микроскопа. Недостаток этого метода — потеря трахей у некоторых пчел.

2.3 Патологический материал после проведения исследований сжигают.

3. Дифференциация клещей

3.1. Клещи рода Акарапис морфологически сходны, мелкие и бесцветные, самки размером 0,07 — 0,14 x 0,1 — 0,21 мм, самцы 0,06 — 0,11 x 0,08 — 0,17 мм, тело сжато в спинно-брюшном направлении, овально-вытянутой формы. Передний отдел тела паразита отделен от заднего поперечным желобком. На спинной стороне имеется 3 щитка. Ротовой аппарат колюще-сосущий, по бокам с вентральной стороны у самок расположены стигмы. Четыре пары ног с характерным набором щетинок.

3.2 Самок клещей рода Акарапис дифференцируют по следующим признакам:

• A. externus: аподема (отходящие книзу от ротового конуса складки покрова, рис. А, 1) занимает 2/3 длины проподосомы (переднего отдела тела); кокса IV (лучше видна при фазово-контрастной микроскопии просветленного материала) усеченная (рис. А, 2); длина последнего членика четвертой пары ног более 11 мкм (рис. А, 3). Чаще всего находят на нижней и боковых поверхностях сочленения между головой и грудью пчелы.
• A. woodi: аподема занимает 2/3 длины проподосомы (рис. Б, 1); поверхность коксы IV с мелким зубцом (рис. Б, 2); длина последнего членика четвертой пары ног меньше 8 мкм (рис. Б, 3). Обитает в трахеях пчел.
• A. dorsalis: аподема занимает полную длину проподосомы (рис. В, 1); кокса IV с глубоким зубцом (рис. В, 2); последний членик четвертой пары ног меньше 10 мкм (рис. В, 3). Паразит на теле пчел локализуется в области скуто-скутеллярной бороздки, у основания крыльев на крыльях и первом брюшном сегменте.

3.3. A. woodi следует дифференцировать от проникающих в трахеи погибших пчел личинок клеща Tyrophagus putrescentae, которые имеют три пары ног, иную сегментацию тела и строение ног.

3.4. Наружных Акараписов необходимо отличать от встречающихся на теле пчел акароидных и других тромбидиформных клещей, используя соответствующие руководства по их определению (например, Определитель обитающих в почве клещей. Л.: Наука, 1977; М.: Наука, 1978 и др.).

А — A. externus; Б — A. woodi; В — A. dorsalis; 1 — аподема;

4. Диагноз

4.1. Диагноз на экзоакарапидоз считается положительным после обнаружения его возбудителей на теле пчел, а на акарапидоз — при выявлении A. woodi в трахеях насекомых.

---