Методические указания по лабораторной диагностике болезни Тешена
(утв. Минсельхозом России 22.03.2002 № 13-5-02/0368)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563). Взамен «Временных методических указаний по лабораторной диагностике болезни Тешена» от 24.01.1996.
Утверждены Минсельхозом России 22 марта 2002 г. № 13-5-02/0368
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА
1. Общие сведения.
1. Лабораторная диагностика болезни Тешена основана на:
а) выделении вируса болезни Тешена из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) или тестикул поросенка (ПТП) или почки поросенка (РК-15) или первичной культуры клеток почки эмбриона свиньи и его идентификации реакцией нейтрализации;
б) обнаружении специфических антител реакцией нейтрализации в сыворотках крови переболевших болезнью Тешена свиней;
в) выделении вируса болезни Тешена из патологического материала биопробой на животных (постановку биопробы проводят по указанию Департамента ветеринарии Минсельхоза России).
Для идентификации вируса болезни Тешена используют «Набор препаратов для идентификации вируса болезни Тешена реакцией нейтрализации», НТД на который утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (Наставление № 13-7-2/2048 от 09.06.2000, ТУ 9388-022-00495549-00).
При проведении лабораторной диагностики руководствуются «Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях», утвержденными Министерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 г.
2. Компоненты и аппаратура для проведения исследования:
- холодильник бытовой;
- шкаф с ламинарным потоком воздуха или настольный бактериологический бокс;
- микроскоп световой любого типа;
- центрифуга рефрижераторная с центробежным ускорением до 3000g с горизонтальным ротором;
- флаконы центрифужные стерильные;
- весы настольные;
- pH-метр;
- воронки стеклянные;
- пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5, 10 см3;
- флаконы стеклянные вместимостью от 10 до 2000 см3;
- пробирки биологические;
- бутыли вместимостью 3 ... 5 дм2;
- вода дистиллированная;
- спирт этиловый технический;
- среда Игла (МЕМ), содержащая L-глутамин;
- сыворотка фетальная КРС;
- культура ПТП или РК-15 или СПЭВ.
3. Отбор и подготовка проб к исследованию.
3.1. Для обнаружения и выделения вируса берут пробы продолговатого мозга, мозжечка и шейного отдела спинного мозга у 3 ... 5 свиней на 1 ... 2-е сутки после установления у животных параличей или в фазе агонии. Пробы отбирают в стерильные флаконы, не менее 5 ... 10 г нервной ткани герметически укупоривают резиновыми пробками. Флаконы снаружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным 20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной одним из указанных дезинфицирующих растворов, укладывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В случае длительной транспортировки (более 2 сут) пробы помещают в 50%-ный раствор глицерина, приготовленного на 0,85%-ном растворе хлористого натрия.
3.2. Для обнаружения специфических антител направляют пробы сыворотки крови от 5 ... 10 свиней, полученные через 20 ... 25 сут после установления первых признаков болезни. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч в термостате при 37 +/- 0,5 °C или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгусток обводят стерильной пипеткой и пробы переносят в камеру бытового холодильника с температурой 4 +/- 0,5 °C на 10 ... 14 ч. Сыворотки отбирают в пенициллиновые флаконы, замораживают и упаковывают в термос.
3.3. Термос опечатывают и доставляют с нарочным в лабораторию с соответствующим сопроводительным документом.
3.4. В лаборатории готовят навески по 2 ... 3 г нервной ткани, отдельно растирают в ступке со стерильным порошком или песком и готовят 20%-ную суспензию на 0,85%-ном растворе хлористого натрия.
3.5. Приготовленные суспензии центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500 ... 3000 об/мин в течение 10 ... 15 мин. В надосадочную жидкость вносят 100 ЕД/см3 пенициллина и 100 мг/см3 стрептомицина (конечная концентрация), выдерживают 1 ч при 37 +/- 0,5 °C.
3.6. Поддерживающей средой Игла МЕМ в пенициллиновых флаконах готовят 10-кратные разведения надосадочной жидкости от 10-0 до 10-6. Полученный материал используют для выделения и идентификации вируса болезни Тешена.
4. Выделение вируса болезни Тешена из патологического материала инокуляцией культуры клеток и идентификация его реакцией нейтрализации.
4.1 Выделение вируса болезни Тешена.
Исследуемый материал, полученный по п. 3.6, вносят в пробирки с культурой клеток по 0,1 см3, предварительно удалив ростовую среду, выдерживают 1,5 ч при (37 +/- 0,5) °C и добавляют 0,9 см3 поддерживающей среды, используя на каждое разведение 4 пробирки. Четыре пробирки с культурой клеток оставляют интактными, заменив ростовую среду на поддерживающую (контроль культуры клеток).
4.2 Идентификация вируса болезни Тешена.
Одновременно с работами, описанными в п. 4.1, исследуемый материал каждого разведения (п. 3.6) вносят в 2 ряда пенициллиновых флаконов по 1 см3, содержащие такое же количество специфической (1-й ряд) и нормальной (2-й ряд) сывороток из «Набора препаратов», взятых в рабочем разведении. Смеси тщательно встряхивают, выдерживают 1,5 ч при 37 +/- 0,5 °C и инокулируют в пробирки (берут по 4 пробирки на каждое разведение исследуемого материала) с культурой клеток по 0,2 см3 и добавляют 0,8 см3 поддерживающей среды. Все пробирки инкубируют при 37 +/- 0,5 °C в течение 6 ... 8 сут.
4.3 Учет результатов.
Культуру клеток ежедневно просматривают под световым микроскопом на наличие ЦПД. При обнаружении ЦПД в культуре клеток, инокулированной исследуемым материалом (п. 4.1) и смесью «исследуемый материал-нормальная сыворотка» (п. 4.2), определяют титр вируса по методу Рида и Менча.
При установлении титра вируса 3,0 lg ТЦД50 и выше определяют индекс нейтрализации (ИН) путем вычитания из логарифма титра вируса в присутствии нормальной сыворотки логарифма титра вируса в присутствии специфической сыворотки.
При ИН 3,0 lg и выше результат считают положительным и выделенный цитопатогенный агент считают вирусом болезни Тешена (табл. 24).
Ориентировочный пример учета результатов выделения и идентификации вируса болезни Тешена в культуре клеток по данным реакции нейтрализации
Примечание. Числитель — количество пробирок с культурой клеток, в которых установлено ЦПД; знаменатель — количество пробирок с культурой клеток, взятых в опыт.
4.4. При отсутствии ЦПД проводят дополнительно 4 последовательных пассажа. Для этого пробирки с культурой клеток, инокулированной исследуемым материалом (п. 4.1) 1-го пассажа в разведении 10-0 ... 10-2, через 6 ... 8 сут инкубирования замораживают при -20 +/- 0,5 °C и оттаивают при 18 ... 25 °C. Культуральную жидкость сливают из пробирок и объединяют, смесь вносят по 1,0 см3 в пробирки с культурой клеток (берут не менее 4 пробирок), предварительно удалив ростовую среду. Пробирки инкубируют при 37 +/- 0,5 °C в течение 6 ... 8 сут. Для проведения последующих пассажей пробирки с культурой клеток 2-го пассажа замораживают при -20 +/- 0,5 °C, оттаивают при 18 ... 25 °C и культуральную жидкость используют для 3-го пассажа и т.д.
При установлении ЦПД в культуре клеток, инокулированной культуральным материалом первого — пятого пассажа, проводят титрование и идентификацию по п. 4.2 выделенного цитопатогенного агента. В случае, если ЦПД не обнаруживают в 5-м пассаже, ставят отрицательный результат выделения вируса и проводят исследования парных сывороток с целью обнаружения вирусспецифических антител.
4.5. При установлении ЦПД в культуре клеток во всех пробирках (пп. 4.1, 4.2), за исключением пробирок «контроль культуры клеток», результат считают отрицательным (в исследуемом материале вирус болезни Тешена не обнаружен). Проводят исследования для идентификации вируса болезни Ауески.
5. Обнаружение специфических антител к вирусу болезни Тешена в сыворотках крови свиней реакцией нейтрализации.
5.1 Подготовка исследуемых сывороток.
Исследуемые сыворотки, полученные по п. 3.2, и сыворотки «Набора препаратов» прогревают при 56 +/- 2 °C 30 мин и готовят двукратное разведение от 1:8 до 1:256 поддерживающей средой.
5.2 Титрование эталонного вируса и определение его рабочей дозы.
В качестве эталонного вируса используют вирус болезни Тешена штамм «Закарпатский». Готовят разведения вируса от 10-1 ... 10-7. Для этого в каждый из 7 флаконов вносят по 4,5 см3 среды Игла (МЕМ). В первый флакон вносят 0,5 см3 вируса и затем отдельной пипеткой переносят по 0,5 см3 в последующие. Культуральную жидкость каждого разведения вносят по 1 см3 отдельной пипеткой в 4 пробирки с выращенной культурой клеток и помещают в термостат при 37 +/- 0,5 °C. 4 пробирки оставляют незараженными, заменяя ростовую среду на поддерживающую (контроль культуры клеток). Состояние культуры клеток каждые 24 ч проверяют световой микроскопией. Учет результатов титрования проводят по ЦПД вируса на 5 ... 6-е сут. При обнаружении ЦПД (округление и отслоение клеток) не менее, чем в половине клеток монослоя и его отсутствие в незараженной культуре клеток определяют титр вируса по методу Рида и Менча.
Определение 1000 ТЦД50 вируса (рабочая доза) вычисляют по формуле: lg разведения культуральной жидкости вируса, содержащего 1000 ТЦД50, равен lg титра ТЦД50 + 3.
Пример: ТЦД50 = 10-6 в 1 см3 культуральной жидкости; -6 + 3 = -3,0 lg разведения культуральной жидкости содержит 1000 ТЦД50, т.е. необходимо приготовить разведение вируса 1:1000.
5.3 Постановка реакции нейтрализации.
5.3.1. Сыворотки каждого разведения по 1 см3 смешивают с равным объемом 1000 ТЦД50 эталонного вируса болезни Тешена, тщательно встряхивают и помещают в термостат на 1,5 ч при 37 +/- 0,5 °C.
5.3.2. После инкубации смеси вносят по 0,2 см3 в пробирки с выращенной культурой клеток, предварительно удалив ростовую среду, и добавляют 0,8 см3 поддерживающей среды. На каждое разведение сыворотки берут по 4 пробирки. В качестве «контроля токсичности» сыворотки первого разведения в объеме 0,1 см3 вносят в 4 пробирки без вируса, добавляя 0,9 см3 поддерживающей среды. Четыре пробирки оставляют интактными, сменив ростовую среду на поддерживающую (контроль культуры клеток). Пробирки помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °C. Результат реакции нейтрализации учитывают через 2 ... 3 сут при установлении 100% ЦПД (дегенеративные изменения клеток всего монослоя) вируса в пробирках, инокулированных смесью «нормальная сыворотка-вирус», и отсутствии признаков ЦПД в пробирках инокулированных смесью «специфическая сыворотка-вирус», в пробирках «контроль токсичности» и «контроль культуры клеток».
5.4 Учет реакции нейтрализации.
5.4.1. Отсутствие ЦПД в культуре клеток, инокулированной смесью «исследуемая сыворотка-вирус» (сыворотки, полученные на 20 ... 25-е сутки) в разведении 1:8 и выше, свидетельствует об обнаружении специфических антител к вирусу болезни Тешена.
6. Постановка биопробы на животных.
6.1. Для постановки биопробы используют 4 здоровых поросят 2 ... 4-месячного возраста, полученных из хозяйств, благополучных по болезни Тешена.
6.2. Животных помещают в изолированные боксы отдельных помещений по два подсвинка в каждый. Содержание и кормление животных должны соответствовать зоотехническим нормам.
6.3. Непосредственно перед введением готовят экстракты 20%-ных суспензий проб нервной ткани животных (пп. 3.4, 3.5), подозреваемых в заболевании болезнью Тешена, при этом общий объем смеси суспензий должен быть не менее 15 см3.
6.4. Перед введением материала берут пробы крови и получают сыворотку по п. 3.2 («нулевая» сыворотка). Подготовленный материал вводят 2 животным интраназально в объеме 5 ... 10 см3 каждому поросенку. За животными ведут клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела в течение 30 сут. При отсутствии клинических признаков болезни или выздоровлении на 30-е сутки у животных отбирают пробы крови для получения сыворотки и постановки реакции нейтрализации.
6.5. В случае установления заболевания поросят, сопровождающегося повышением температуры до 40,5 ... 41 °C, угнетением, отсутствием аппетита, легкого пареза, переходящего в паралич, животных убивают в стадии агонии, отбирают пробы нервной ткани головного и спинного мозга (п. 3.1) и проводят выделение и идентификацию вируса по пп. 4.1, 4.2.
6.6. В случае отсутствия клинических признаков заболевания или выздоровления животных исследуют сыворотки проб крови (п. 3.2) в реакции нейтрализации. Реакцию нейтрализации ставят по п. 5.3, при этом исследуемые сыворотки берут в двукратных разведениях от 1:8 до 1:256.
6.7. В случае получения положительных результатов при выделении и идентификации вируса из патологического материала или при обнаружении реакцией нейтрализации специфических антител к вирусу болезни Тешена в сыворотках проб крови, полученных на 30-е сутки в разведении 1:8 и выше, результат биопробы считают положительным (наличие болезни Тешена), при получении отрицательных результатов — отрицательным (отсутствие болезни Тешена).
7. Постановка лабораторного диагноза.
Диагноз на болезнь Тешена считают установленным в случае:
- выделения и идентификации вируса болезни Тешена из проб головного и спинного мозга;
- обнаружения специфических антител в сыворотках, полученных от свиней из хозяйств, не применяющих вакцинацию против болезни Тешена в разведении 1:8 и выше;
- установления четырехкратно увеличения титра антител;
- получения положительных результатов биопробы на животных.
С утверждением настоящих «Методических указаний» на территории Российской Федерации утрачивают силу «Временные методические указания по лабораторной диагностике болезни Тешена» от 24 января 1996 г.
Методические указания по лабораторной диагностике болезни Тешена разработаны в лаборатории «Диагностика» Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (заведующий лабораторией, доктор ветеринарных наук В.В. Куриннов; старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Е.А. Балашова).