Методические указания по определению возбудителей диплостомозов пресноводных рыб

(утв. Минсельхозпродом России 22.09.1998 № 13-4-2/1404)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ДИПЛОСТОМОЗОВ ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ

1. Общие положения

1.1. В фауне России и сопредельных государств выявлено 17 видов рода метацеркарий трематод рода Diplostomum (отряд Strigeidida, семейство Diplostomidae), каждый из которых вызывает самостоятельную форму заболеваний. Для их обозначения к названию «диплостомоз» добавляется соответствующая данному виду возбудителя литера латинского алфавита (Приложение 1 — не приводится).

1.2. Видовая принадлежность возбудителей и вызываемых ими форм диплостомозов определяется по инвазионным метацеркариям и при строгом соблюдении описанной ниже методики сбора и фиксации, приготовления постоянных препаратов и морфометрического анализа, а также с учетом гостальной специфичности (приуроченности к определенной более или менее узкой группе хозяев) метацеркарий, а также их строгой приуроченности к обитанию в определенных органах рыбы (глаза, головной мозг) или отдельных составных частей глаза (хрусталик, стекловидное тело, внутренние оболочки и жидкие среды глаза).

2. Исследование рыб

2.1. Для исследования берут 10 — 15 экземпляров свежеуснувших рыб обследуемого вида и составляют протокол их исследования, в котором регистрируется дата исследования, вид рыбы и место ее вылова.

2.2. Каждую рыбу взвешивают, измеряют длину от вершины рыла до основания лучей хвостового плавника, проводят визуальный осмотр рыбы с обращением особого внимания на наличие патологических изменений глаз (изменение формы и размеров зрачка, патология глазного яблока), а также точечных кровоизлияний на жаберных крышках и в основании плавников. Выявленные патологии описывают и заносят в протокол обследования рыб.

2.3. На наличие метацеркарий рода Diplostomum обследуют глаза и головной мозг рыб и круглоротых.

2.4. Глаза извлекают из орбит и вскрывают с помощью ножниц или препаровальных игл на часовом стекле или чашке Петри в тонком слое воды. Хрусталики и стекловидное тело глаза переносят на отдельные часовые стекла с речной водой, а с внутренних стенок глазного яблока делают соскоб пинцетом.

2.4.1. Хрусталики и стекловидное тело сразу же (пока они не потеряли своей прозрачности) просматривают под бинокуляром, а при наличии в них паразитов разрывают препаровальными иглами на мелкие части и на 0,5 — 1,0 час оставляют в воде. За это время находящиеся в тканях этих органов метацеркарии сами выйдут в воду и могут быть собраны тонко оттянутой пипеткой. Молодые, еще неинвазионные метацеркарии при этом успевают погибнуть, а инвазионные сохранятся в живом виде.

2.4.2. Соскоб с внутренних стенок глаза обследуют компрессорно под бинокуляром. Обнаруженных метацеркарий аккуратно извлекают из содержимого глазного яблока, отмывают в пресной воде. Если метацеркарий в содержимом глазного яблока очень много (десятки и сотни), отмывку их удобнее производить в 0,2 л стаканчике методом отмучивания и последовательных сливов.

2.5. Головной мозг извлекают пинцетом из черепной коробки через вскрытую крышу черепа, помещают на часовое стекло с водой и обследуют визуально на наличие кровоизлияний на сосудистой оболочке мозга и в мозговой ткани. Для выявления метацеркарий рода Diplostomum головной мозг исследуют под бинокулярным микроскопом компрессорным способом, либо — если метацеркарий очень много, — методом отмучивания и последовательных сливов.

2.6. Собранных метацеркарий подсчитывают (отдельно инвазионных и неинвазионных), отмывают водой, а перед фиксацией изучают прижизненно.

3. Изучение живых метацеркарий

3.1. По живым метацеркариям уточняют их принадлежность к роду Diplostomum и выявляют некоторые специфические особенности их морфологии. Для этого собранных метацеркарий помещают на предметное стекло с лупкой и исследуют их под малым увеличением микроскопа, обращая основное внимание на форму, количество и характер расположения известковых телец в теле метацеркарий.

3.2. По форме и размерам известковых телец дифференцируют метацеркарий рода Diplostomum от таковых рода Tylodelphys: у первых известковые тельца имеют шаровидную форму и разные размеры, у вторых они овальные и практически одинаковые по размерам.

3.3. Количество и характер расположения известковых телец в теле метацеркарий рода Diplostomum один из важных морфологических критериев вида метацеркарий (Рис. 1). Отмечают, к каким из изображенных на указанном рисунке видам обнаруженные метацеркарии наиболее близки по числу известковых телец и характеру их расположения. В глазах одной и той же особи рыбы могут одновременно паразитировать несколько видов рода Diplostomum.

3.4. Отсутствие известковых телец в теле метацеркарий рода Diplostomum свидетельствует о том, что эти метацеркарии либо еще молодые и не достигли инвазионной стадии развития (чаще встречаются у молоди рыб), либо уже старые, утратившие свою инвазионность особи (чаще обнаруживаются у рыб старше пяти лет).

4. Фиксация и окраска метацеркарий, приготовление постоянных препаратов

4.1. Фиксацию и окраску метацеркарий проводят уксуснокислым кармином путем добавления краски к живым метацеркариям в минимальном количестве воды. Делать это удобнее всего в биологической пробирке объемом не более 4 — 5 мл. Соотношение объема краски и воды в пробирке должно быть не менее 10:1. Все последующие манипуляции по подготовке метацеркарий для монтажа в постоянном препарате осуществляют в той же пробирке путем последовательной смены в ней реактивов тонко оттянутой пипеткой.

4.2. Через 15 — 20 минут краску слить и заменить на 5 — 10 минут таким же объемом 1% раствора соляной кислоты в 70° этиловом спирте (дифференцировка окраски).

4.3. Обезвоживание окрашенных метацеркарий производят спиртами возрастающей крепости (85° и двойная смена 96° этилового спирта), просветление — диметилфталатом (диметиловый эфир фталевой кислоты). Диметилфталат вносят в пробирку специальной «диметилфталатовой» пипеткой, медленно выпуская его по стенке пробирки, непосредственно в спирт. Метацеркарии при этом оказываются на границе более легкого спирта и диметилфталата. Просветление считается законченным, когда метацеркарии опустятся на дно пробирки. После этого поверхностные слои спирта и смеси спирта с диметилфталатом удаляют и заменяют чистым диметилфталатом.

4.4. Монтаж препарата производят на предметном стекле. Для этого в центр предметного стекла помещают каплю диметилфталата с метацеркариями, излишки диметилфталата насколько возможно удаляют и наносят каплю жидкого бальзама, расправляют ее препаровальной иглой, а метацеркарий равномерно (лучше рядами) размещают на стекле. Через 1 — 3 часа, когда препарат слегка подсохнет, на него наносят одну — две капли жидкого бальзама и накрывают покровным стеклом. Препарат этикетируют и хранят в течение первого года (пока не высохнут) на лежачих лоточках.

4.5. Если нет возможности завершить процесс изготовления препарата сразу, то его можно прервать на неограниченно долгое время на двух этапах: после дифференцировки окраски, поместив метацеркарий в пробирку с 70° спиртом, или оставить метацеркарий в пробирке с диметилфталатом.

4.6. Приготовление уксуснокислого кармина: в 100 мл 45%-ной уксусной кислоты растворить (на водяной бане!) 3 — 4 г мелко растертого порошка кармина; остывший раствор отфильтровать и разбавить 45%-ной уксусной кислотой в соотношении 1:1. Хранить в плотно закрытой стеклянной посуде.

5. Определение родовой и видовой принадлежности возбудителей диплостомозов пресноводных рыб

5.1. В отличие от большинства метацеркарий трематод, встречающихся в глазах и головном мозге рыб и круглоротых, метацеркарий рода Diplostomun ведут активный (подвижный) образ жизни, никогда не образуя вокруг себя ни цист, ни капсул. В этом отношении они близки только к метацеркариям рода Tylodelphys, от которых, как уже отмечалось, четко отличаются формой и размерами известковых телец (см. п. 3.2).

5.2. Для видовой диагностики возбудителей диплостомозов рыб используют помимо уже отмеченных выше биологических (гостальная специфичность и приуроченность к обитанию и строго определенных органах рыбы) и морфологических (число известковых телец) признаков целый ряд морфометрических критериев вида, а именно: длину (A в мкм), ширину (B в мкм) и произведение длины на ширину (A x B) тела, ротовой и брюшной присосок, органа Брандеса; расстояние от переднего конца тела до центра брюшной присоски (O в мкм); отношения AB тела к AB органа Брандеса и к AB брюшной присоски; AB органа Брандеса и AB ротовой присоски к AB брюшной присоски; выраженное в процентах отношение B и O к A тела (Рис. 2).

5.3. Определение видовой принадлежности метацеркарий проводят по определительной таблице (Приложение 2 — не приводится).

6. Меры безопасности и личной гигиены

6.1. Лица, проводящие исследования рыб на их зараженность возбудителями диплостомозов, сбор, фиксацию и окраску метацеркарий, а также приготовление реактивов и постоянных препаратов из метацеркарий, должны работать в халатах и соблюдать правила работы с ядовитыми (ледяная уксусная кислота) и огнеопасными (этиловый спирт, диметиловый эфир фталевой кислоты) веществами.

6.2. Приготовление (варка) уксуснокислого кармина должно производиться в вытяжном шкафу и только на водяной бане.

6.3. После окончания работы вымыть руки и лицо теплой водой с мылом, а место работы обработать 2%-ным раствором кальцинированной соды.

---