Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб
(утв. Минсельхозпродом России 22.09.1998 № 13-4-2/1403)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563). Взамен Методических указаний по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб, утв. ГУВ Госагропрома СССР 12.06.1986.
Утверждаю Заместитель начальника Департамента ветеринарии В. В. Селиверстов 22 сентября 1998 года № 13-4-2/1403
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ПСЕВДОМОНОЗОВ РЫБ
С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу «Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 12.06.1986 г.
1. Общие положения
1.1. Псевдомоноз — инфекционная болезнь тепловодных, холодноводных и аквариумных рыб, встречающаяся в прудовых и индустриальных хозяйствах.
1.2. Возбудителями псевдомоноза являются вирулентные штаммы бактерий рода Pseudomonas. Чаще всего встречаются виды Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. aureofaciens, Ps. cyprinisepticum, Ps. intestinalis, Ps. anguilliseptica, Ps. chlororaphis. Каждый из этих видов может вызвать заболевание самостоятельно, в ассоциации друг с другом или другими микроорганизмами.
1.3. Для бактериологического исследования берут только живую больную рыбу. В каждом случае исследуют не менее 5 экземпляров рыб с признаками болезни.
2. Бактериологическое исследование
2.1. Высевы производят из асцитной жидкости, печени, почек, селезенки, из крови (отдельно из каждой пробы) на чашки с МПА (pH 7,2 — 7,4).
2.2. Заболевание характеризуется септическим течением, поэтому в посевах из крови и паренхиматозных органов, как правило, обильный рост культуры возбудителя.
2.3. Посев можно производить инокуляционной петлей, погружая ее в обследуемый орган и поворачивая несколько раз, или пинцетом с изогнутыми браншами.
2.4. Посевы инкубируют при 25 — 26 °C в течение 48 — 72 часов. На МПА бактерии рода Pseudomonas образуют бесцветные или серовато-белые полупрозрачные, круглые выпуклые колонии с ровными краями. На 3 — 4-е сутки отмечают образование желто-зеленого или оранжево-желтого флюоресцирующего пигмента. Ps. cyprinisepticum и некоторые штаммы Ps. fluorescens могут образовывать слизистые колонии.
2.5. При обнаружении на агаре характерного роста подозрительные колонии пересевают на среду Клиглера и через 18 часов культуры, давшие на этой среде щелочную реакцию (столбик и скошенная поверхность окрашиваются в малиновый цвет), подвергают дальнейшему изучению. Для дифференциации возбудителей рода Pseudomonas от бактерий сходных с ними родов (табл. 1) определяют оксидазную активность, способность расщеплять глюкозу в среде Хью-Лейфсона (тест окисления-ферментации).
2.5.1. Для определения оксидазной активности на небольшой участок скошенной поверхности с культурой наносят каплю смеси реактивов — 1%-ного водного раствора диметилпарафенилендиамина (гидрохлорида или оксалата) и 1%-ного раствора \alpha - \text{нафтола} в 60° спирте-ректификате. Оксидазоположительные колонии окрашиваются в синий цвет через 30 — 60 секунд. Оксидазоотрицательные культуры дальше не исследуются.
2.5.2. При проведении теста окисления-ферментации (О/Ф) исследуемую культуру засевают уколом до дна в пробирку с 6 мл среды Хью-Лейфсона. Посевы инкубируют 96 часов при 25 — 26 °C. Возбудители псевдомоноза окисляют глюкозу в аэробных условиях, поэтому среда в верхних слоях становится соломенно-желтой, нижний слой остается без изменения — ферментация не происходит.
2.5.3. В случае сомнительного результата теста окисления-ферментации проводят дополнительные исследования декарбоксилазной активности выделенных культур. Исследуемую культуру высевают в четыре пробирки со средой Меллера или Биргер-Крушинской, в три из которых добавлено по одной из аминокислот (аргинин, лизин, орнитин), четвертая — контрольная. Затем на поверхность среды наслаивается стерильное вазелиновое масло (примерно 1 мл). Посевы инкубируют 4 суток при 25 — 26 °C. Возбудители псевдомоноза обладают аргинин-дегидролазой, но не декарбоксилируют лизин и орнитин, в результате чего цвет среды Биргер-Крушинской в пробирке с аргинином становится синим. Цвет среды Меллера изменяется до фиолетового, при слабой реакции становится голубовато-серым.
2.5.4. Для определения видовой принадлежности культур проводят высевы на среды Гисса с маннитом, сахарозой, мальтозой, лактозой (см. табл. 2).
2.5.5. Подвижность культуры определяют при посеве на среду Хью-Лейфсона. Подвижные культуры растут диффузно, вызывая помутнение всей среды, неподвижные — строго по уколу (Ps. fluorescens f. capsulata).
3. Биологическое исследование
3.1. Биологическую пробу ставят на 6 — 10 клинически здоровых рыбах того же вида и возраста, от которых выделена культура возбудителя, завезенных из хозяйства, благополучного по данному заболеванию.
3.2. Двухсуточную бульонную культуру вводят 4 — 6 рыбам внутримышечно и 4 — 6 рыбам внутрибрюшинно в дозе 0,3 мл. Рыбам массой более 150 г вводят по 0,5 мл культуры. Температура воды в аквариуме, где содержится зараженная рыба, должна быть в пределах 15 — 25 °C.
3.3. Одновременно ставят контроль на 6 — 10 рыбах, которым вводят стерильный МПБ в тех же дозах. Срок наблюдения — 16 суток.
3.4. В случае проявления заболевания или гибели рыб проводят бактериологическое исследование.
3.5. Биологическую пробу считают положительной, если все зараженные рыбы заболевают и не менее 50% из них погибает с признаками псевдомоноза, а из крови и внутренних органов реизолируют исходную культуру.
3.6. Лабораторный диагноз на псевдомоноз считают установленным при выделении культуры со свойствами, характерными для возбудителей болезни, и патогенной для подопытных рыб.
Приложение 1
Дифференциация бактерий рода Pseudomonas от бактерий сходных с ними родов
Дифференциация представителей рода Pseudomonas
1. Среда Хью-Лейфсона. Состав: пептона — 2,0 г, хлорида натрия — 5,0 г, калия фосфорнокислого двухзамещенного (K2HPO4) — 0,3 г, бромтимолового синего — 0,03 г, агар-агара — 3,0 г, дистиллированной воды — 1000 мл. Компоненты смешивают, расплавляют агар, pH смеси доводят до 7,1 — 7,2. Среду кипятят, разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм (120 °C) 20 мин. После охлаждения смеси до 45 — 50 °C в каждую пробирку стерильно вносят по 0,3 мл 10%-ного стерильного раствора глюкозы. Готовая среда травянисто-зеленого цвета.
2. Среда Меллера. Состав: пептона — 5,0 г, мясной воды (вода и мясо берутся в соотношении 1:1) — 300,0 мл, бромкрезоловый красный 1,6%-ный раствор — 0,625 мл, крезоловый красный 0,2%-ный водный раствор — 2,5 мл, D-глюкозы — 0,5 г, пиридоксаля (можно витамина B6) — 5,0 г, дистиллированной воды — 1000 мл. Компоненты смешивают, pH смеси доводят до 6,0 или 6,5. Затем среду делят на 4 части, в три из которых добавляют по 1% одной из аминокислот — 1-аргинина, 1-лизина, 1-орнитина, (DL-формы — 2%). Четвертая часть среды (без аминокислоты) — контрольная. В пробирках с орнитином pH среды устанавливают после добавления аминокислоты, перед стерилизацией. Среду разливают в пробирки по 2 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм (120 °C) 20 мин.
3. Среда Биргер-Крушинской. Состав: гидролизата казеина (пептона) — 5,0 г, дрожжевого экстракта — 3,0 мл, глюкозы — 1,0 г, индикатора бромтимолового синего — 45,0 мл (0,1%-ного раствора в 20%-ном спирте), дистиллированной воды — 1000 мл. Компоненты смешивают, устанавливают pH смеси 6,0 — 6,2. Среду делят на 4 части, в три из которых добавляют по 1% одной из аминокислот — 1-аргинина, 1-лизина, 1-орнитина, (DL-формы — 2%). Четвертая часть среды (без аминокислоты) — контрольная. В пробирках с орнитином pH среды устанавливают после добавления аминокислоты, перед стерилизацией. Среду разливают в пробирки по 2 — 4 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня или в автоклаве при 0,5 атм 15 мин.