Временная инструкция по борьбе с вибриозом рыб
(утв. Минсельхозпродом России 26.05.1998 № 13-4-2/1249)
Примечание
Взамен Методических указаний по лабораторной диагностике вибриоза рыб, утв. ГУВ МСХ СССР 30.03.1983 и Временной инструкции о мероприятиях по борьбе с вибриозом радужной форели, утв. ГУВ МСХ СССР 30.03.1983.
Утверждаю Руководитель Департамента ветеринарии В. М. Авилов 26 мая 1998 года № 13-4-2/1249
ВРЕМЕННАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО БОРЬБЕ С ВИБРИОЗОМ РЫБ
Временная инструкция по профилактике и ликвидации с вибриозом рыб разработана взамен Методических указаний по лабораторной диагностике вибриоза рыб, утвержденных ГУВ МСХ СССР 30.03.1983 г. и Временной инструкции о мероприятиях по борьбе с вибриозом радужной форели, утвержденной ГУВ МСХССР 30.03.1983 г.
1. Вибриоз — инфекционное заболевание, чаще поражающее рыб и других гидробионтов, обитающих в соленых, солоноватых и реже — в пресных водах.
Заболевание вибриозом регистрируют у лососевых рыб, угря, щуки, плотвы, окуня, камбалы, трески, сельдевых и рыб других видов.
Болезнь чаще всего протекает в острой септической форме, а при эпизоотиях и после лечения антибиотиками — в хронической форме.
Возбудитель болезни — бактерии Vibrio anguillarum, входят в род Vibrio, семейство Vibrionaceae.
2. Диагноз на вибриоз устанавливают:
- по результатам изучения культуральных, морфологических и ферментативных свойств возбудителя, выделенного при бактериологическом исследовании патологического материала от рыб, при наличии у рыб клинических признаков и патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни, а в случае бессимптомного течения болезни при гибели рыб;
- при получении положительного результата биопробы с использованием возбудителя болезни, выделенного из патологического материала от рыб и наличии у рыб клинических признаков и патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни, а в случае бессимптомного течения болезни при гибели рыб;
- при положительном результате серологического типирования возбудителя, выделенного из патологического материала от рыб, при наличии у рыб клинических признаков и патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни, а в случае бессимптомного течения болезни при гибели рыб;
- при положительном результате исследования сыворотки крови рыб в РА с антигеном эритроцитарным вибриозным и наличии у рыб клинических признаков и патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни, а в случае бессимптомного течения болезни при гибели рыб.
В каждом случае при постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные.
3. При подозрении на вибриоз рыб ветеринарный врач, обслуживающий рыбоводный завод или рыбоводное хозяйство, совместно с представителем завода (хозяйства) выясняет:
- время зарыбления водоемов и рыбоводно-биологические показатели;
- показатели температуры воды в водоемах и содержание в ней кислорода в течение недели перед заболеванием;
- время появления первых случаев заболевания;
- динамику отхода рыб в каждом садке (бассейне);
- состав и качество кормов и режим кормления;
- плотность посадки рыб и возможность загрязнения воды.
О возникшем заболевании ветеринарный врач сообщает руководителю завода (хозяйства), главному ветеринарному врачу района, направляет материал для лабораторного исследования и организует мероприятия по ликвидации и недопущению распространения болезни.
4. При подтверждении диагноза рыбоводный завод (рыбоводное хозяйство) в установленном порядке объявляют неблагополучным по вибриозу рыб. Главный ветеринарный врач района берет такой завод (хозяйство) на учет и совместно с руководителем и специалистами завода (хозяйства) разрабатывает план оздоровительных, ветеринарно-санитарных и организационно-хозяйственных мероприятий в соответствии с действующими Ветеринарно-Санитарными правилами для рыбоводных хозяйств и Ветеринарно-Санитарными правилами для лососевых рыбоводных заводов.
5. В неблагополучных по вибриозу заводах (хозяйствах) вводят ограничения, при которых запрещается:
- ввоз и вывоз икры и живой рыбы для целей разведения и выращивания;
- вывоз кормов, изготовленных из больных рыб, и использование их в корм рыбам без термической обработки;
- пересаживание рыб из неблагополучных по вибриозу садков (бассейнов) в благополучные и наоборот;
- использование орудий лова, оборудования, инвентаря из неблагополучных садков (бассейнов) для работы в благополучных.
6. В водоемах (емкостях), где установлено заболевание, прекращают кормление рыб до начала лечения, затем назначают качественные витаминизированные, а также лечебные корма в количестве 50 — 70 процентов от нормы.
7. В водоемах (емкостях), где установлено заболевание, повышают аэрацию за счет увеличения подачи холодной пресной воды из глубоких мест водозабора или артезианских скважин, при возможности садки отбуксировывают или притапливают в зоны с более низкой температурой воды.
8. Ветеринарный врач, обслуживающий завод (хозяйство), проводит ежедневный клинический осмотр рыб в водоемах и организует сбор погибшей рыбы с последующим ее обеззараживанием и утилизацией.
9. Ограничения с рыбоводного завода (рыбоводного хозяйства) снимают и объявляют его благополучным по вибриозу рыб по истечении одного года, а с естественного водоема — по истечении двух лет после полного прекращения заболевания (отсутствие у рыб клинических признаков болезни, отрицательные результаты бактериологических исследований рыб) и только после проведения комплекса оздоровительных ветеринарно-санитарных и организационно-хозяйственных мероприятий.
10. Для лечения рыб применяют фуразолидон, окситетрациклин, тетрациклин, левомицетин.
10.1. Выбор препарата, его дозировку и продолжительность лечения определяют в зависимости от чувствительности возбудителя к препарату, формы течения заболевания, возраста и состояния рыбы, температуры воды и других факторов.
10.2. Фуразолидон при остром течении вибриоза применяют для лечения всех возрастных групп в течение 10 дней из расчета 9 г на 100 кг массы первый день и по 8 г в последующие дни лечения.
10.3. При хроническом течении вибриоза фуразолидон применяют в течение 10 дней из расчета 10 г на 100 кг массы рыбы в день. При необходимости после окончания первого курса лечения проводят второй.
10.4. При температуре воды выше 17 °C, а также при появлении первых признаков болезни, рыбам назначают фуразолидон в течение 10 дней в дозе 7 — 8 г на 100 кг массы рыбы в день.
10.5. Окситетрациклин дают из расчета 7 г на 100 кг массы рыбы в течение 10 дней.
10.6. Левомицетин применяют из расчета 5 г на 100 кг массы рыбы в первый день и по 3 г в течение 2 — 6 последующих дней лечения.
10.7. Товарную рыбу, получавшую препараты, нельзя направлять в реализацию ранее, чем через 30 дней после окончания лечения.
11. В целях профилактики вибриоза рыб посадочный материал следует отбирать из хозяйств, благополучных по данной болезни. Рыбы не должны иметь травматических повреждений и признаков других болезней.
12. Из пресной воды в морскую и солоноватую переводят рыб не моложе двухлетнего возраста, массой не менее 100 г. Перемещают их постепенно: каждому изменению солености на 5‰ должен предшествовать период в 4 — 5 дней.
13. При перевозках и пересадках рыбы нельзя допускать резких колебаний температуры воды (предельная разница 2 — 2,5 °C). Температура воды в акваториях, куда помещают садки с посадочным материалом, должна быть не выше 20 °C.
14. В период выращивания рыб необходимо следить за качеством кормов и режимом кормления, не допускать воздействия на рыб стрессовых факторов.
15. Для создания резистентного к вибриозу маточного стада следует отбирать особей, не болевших в период вибриозной эпизоотии и имеющих нормальные физиологические показатели.
16. В хозяйствах необходимо осуществлять мероприятия, предусмотренные действующими ветеринарно-санитарными правилами для рыбоводных хозяйств.
17. В общий комплекс мероприятий против вибриоза рыб должна быть включена специфическая профилактика болезни с применением вакцин, принятых в ветеринарную практику.
Приложение № 1
к Временной инструкции по борьбе с вибриозом рыб от 26 мая 1998 г.
1. Возбудитель вибриоза рыб — бактерии Vibrio anguillarum представляют собой короткие, тонкие (1,6 — 2,5 x 0,4 — 1,0 мкм), слабоизогнутые грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул. Активную подвижность бактерий обеспечивает один полярно расположенный жгутик. Бактерии являются факультативными анаэробами. Они продуцируют протеолитические ферменты и токсины.
Бактерии Vibrio anguillarum выделяют из воды, ила и от гидробионтов. Возбудитель болезни попадает в организм рыбы через жабры, оральным и анальным путями.
2. При подозрении на вибриоз обращают внимание на частоту и время вспышек болезни со сходной клинической картиной, температуру воды и ее соленость, динамику заболевания и отход рыбы:
а) рыбы заболевают вибриозом преимущественно в летние месяцы при нагревании воды до температуры выше 16 °C. Заболевание достигает максимума при температуре 19 — 20 °C;
б) максимальный отход рыбы регистрируется при солености воды 6,5 - 8,5‰ ;
в) наибольшие потери (гибель) регистрируют среди годовиков и сеголетков в первый месяц с момента заболевания, особенно при высокой плотности посадки.
3. Из клинических признаков при остром течении болезни у рыб в первую очередь регистрируют отказ от корма и снижение двигательной активности. У части рыб наблюдается ерошение чешуи, покраснение кожных покровов у основания плавников, анального отверстия и в других частях брюшной стенки, а также геморрагии, некротические изменения и изъязвления в коже и мышцах. У части рыб болезнь протекает бессимптомно, но со значительным отходом, особенно среди годовиков и двухлетков. При бактериологическом исследовании возбудитель болезни легко высевается из крови.
При хроническом течении болезни (свыше 7 — 8 недель) характерным признаком является наличие в мышцах рыб абсцессов и длительно незаживающих язв. Возбудитель болезни редко высевается из крови, но высевается из внутренних органов.
4. Патологоанатомические изменения характеризуются выраженной гиперемией и геморрагиями тканей внутренних органов при увеличении их размеров, наличием интрамускулярных абсцессов, некрозов и язв, а в брюшной полости — асцитной жидкости. Желудок и кишечник пустые, гиперемированные. Анус выпяченный и отечный. Кожа на разрезе в месте припухлостей темно-красного цвета, мышечная ткань дряблая.
5. При бактериологическом исследовании на вибриоз патологический материал отбирают только от живых рыб:
5.1. Для исследования берут пробы крови из сердца и содержимого брюшной полости, материал из полости абсцессов и стенок язв, сердце, печень, селезенку и почки.
5.2. Место отбора материала прижигают шпателем, после чего стерильной пастеровской пипеткой отбирают пробу материала и переносят ее в одну пробирку с 6 см3 мясо-пептонного бульона (МПБ — см. приложение № 2, п. 1.1) или пептонной воды, содержащих 1,5% хлорида натрия. После 2 — 3 пипетирований посевной материал в объеме 0,5 — 1,0 см3 засевают в две пробирки на скошенный мясо-пептонный агар (МПА — см. приложение № 2, п. 1.2) с 1,5% хлористого натрия и в две пробирки на скошенный дифференциально-диагностический агар (ДДА — см. приложение № 2, п. 1.3). Посевы инкубируют при температуре 20 — 22 °C. Учет проводят каждый день в течение 7 суток. Полученные культуры подвергают бактериоскопии. Затем определяют их подвижность и галофильность, оценивают рост колоний при посеве на обычные и дифференциальные среды и ставят с ними биопробу.
5.3. Бактериоскопия. На чистое обезжиренное стекло наносят стандартной бактериологической петлей (диаметр 2 мм) каплю физиологического раствора, тщательно суспендируют в ней небольшое количество исследуемой культуры и равномерно распределяют суспензию по поверхности стекла. Препарат высушивают при комнатной температуре и фиксируют путем проведения 5 — 6 раз над пламенем горелки. После охлаждения препарат окрашивают по Граму. Вначале — в течение 2 мин карболовым раствором генцианового фиолетового. Смыв краску водой, препарат помещают на 2 мин в раствор Люголя. Затем в течение 30 секунд обрабатывают 96%-ным спиртом. Тщательно отмыв препарат от спирта, окрашивают его в течение 2 мин фуксином Пфейфера.
После промывания водой и просушивания фильтровальной бумагой препарат микроскопируют при увеличении 10 x 90 под иммерсией. Бактерии, окрасившиеся в синий цвет считают грамположительными; в красный цвет — грамотрицательными. Вибрионы грамотрицательны.
5.4. Определение подвижности. На обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей каплю физиологического раствора, суспендируют в ней небольшое количество испытуемой культуры и накрывают покровным стеклом. Препарат микроскопируют при увеличении 10 x 90. Бактерии Vibrio anguillaram активно подвижны.
5.5. Определение галофильности. Исследуемую культуру высевают на МПА без содержания хлористого натрия и на МПА с 1,5-, 3-, 7-, 10% хлористого натрия, скошенный в пробирках. Посевы инкубируют при 20 — 22 °C в течение 48 часов. Оценку результатов теста проводят, исходя из того, что культуры Vibrio anguillarum, кроме типа C, не растут на среде без содержания хлористого натрия, а также, что все они не растут при содержании в среде 7,0% и более хлористого натрия, но хорошо растут при концентрации соли от 0,25 до 5,2%.
5.6. Оценка роста вибрионов на плотных питательных средах. Испытуемые культуры бактерий, сходные по культуральным свойствам и морфологии с вибрионами, суспендируют в стерильном физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы концентрация микробных клеток составила 1 млрд/см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК. Приготовленные суспензии разводят последовательно десятикратно до 10-6 и из последних разведений в объеме 0,1 см3 высевают на МПА с 1,5% хлористого натрия и ДДА, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при температуре 20 — 22 °C в течение 48 часов.
На МПА вибрионы растут в виде прозрачных, светлых выпуклых колоний с ровными краями, имеющих в проходящем свете светло-голубоватый оттенок.
По оценке роста колоний на ДДА проводят ориентировочную дифференциацию вибрионов от других микроорганизмов. На данной среде вибрионы формируют колонии желтого цвета, без изменения цвета среды вокруг колоний. Также в виде колоний желтого цвета на ДДА растут некоторые штаммы аэромонад и псевдомонад, но среда вокруг колоний становится синеватой. Колонии V. parachemolyticus на этой среде имеют голубоватый цвет.
Типичные для Vibrio anguillarum колонии отбирают бактериологической петлей и пересевают на МПА с 1,5% хлористого натрия, скошенный в пробирках. Посевы инкубируют при температуре 20 — 22 °C в течение 24 — 48 часов. Выращенные культуры используют для постановки биопробы и изучения ферментативных свойств бактерий.
5.7. Биопроба. Для определения патогенности односуточную культуру вибрионов суспендируют в физиологическом растворе и вводят 3 — 5 рыбам аналогичного вида массой 100 — 200 г внутримышечно и 3 — 5 рыбам — внутрибрюшинно в дозе 200 млн микробных клеток в объеме 0,2 см3.
Из пяти рыб-аналогов формируют контрольную (без введения культуры) группу и выдерживают ее в отдельном аквариуме. Температура воды в аквариумах должна быть 18 — 20 °C. Срок наблюдения 18 суток.
В случае заболевания или гибели инфицированной рыбы проводят бактериологическое исследование взятого от нее патологического материала, с последующей идентификацией выделенной культуры по результатам серологического исследования с агглютинирующей сывороткой против Vibrio anguillarum, или — результатам изучения ферментативных свойств.
Биологическая проба считается положительной, а диагноз на вибриоз установленным при проявлении не менее чем у 50% рыбы, инфицированной испытуемой культурой, клинических признаков болезни или при ее гибели и выделении от такой рыбы культуры Vibrio anguillarum. Рыбы контрольной группы, при этом, должны оставаться живыми.
6. Изучение ферментативных свойств:
6.1. Определение продукции цитохромоксидазы. \alpha - \text{Нафтол} в количестве 30 — 40 мг растворяют в 2,5 см3 96%-ного этилового спирта (ректификованного), затем прибавляют 7,5 см3 дистиллированной воды и 60 см3 диметилпарафенилендиамина. Реактив готовят ex tempore и обрабатывают им полоски фильтровальной бумаги размером 1,5 x 9 см. Исследуемую культуру наносят штрихом с помощью бактериологической петли на обработанную реактивом полоску бумаги. Если на полоске бумаги в месте нанесения культуры появляется синее окрашивание, культуру оценивают как оксидазоположительную. Если цвет не изменяется — как оксидазоотрицательную. Бактерии Vibrio anguillarum оксидазоположительные.
6.2. Определение продукции сероводорода. Полоску фильтровальной бумаги (1 x 10 см), обработанную насыщенным водным раствором уксуснокислого свинца и высушенную в термостате, помещают в пробирку со скошенным МПА с 1,5% NaCl непосредственно после засева испытуемой культуры таким образом, чтобы нижний край полоски находился на расстоянии 1 см от питательной среды. Посевы инкубируют при температуре 20 — 22 °C в течение 5 суток. Результаты учитывают ежедневно. Почернение нижней части полоски фильтровальной бумаги оценивают как положительный результат. Бактерии Vibrio anguillarum сероводород не продуцируют.
6.3. Тест окисления ферментации на среде Хью-Лейфсона. Среду, состоящую из 3,0 г агара; 2,0 г пептона; 15,0 г хлорида натрия; 0,3 г двузамещенного фосфатнокислого калия; 3 см3 1% водного раствора бромтимолблау; 1000 см3 дистиллированной воды стерилизуют при 121 °C (1 атм) в течение 15 мин. После охлаждения до 45 — 50 °C в среду вносят 25 см3 40%-ного раствора глюкозы и разливают по 3 см3 в пробирки. Исследуемую культуру засевают уколом в две пробирки со средой. Стерильной пипеткой на поверхность среды одной из пробирок наносят 1 см3 стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 22 — 25 °C в течение 4 суток. Видовую принадлежность культуры оценивают, исходя из того, что вибрионы и аэромонады ферментируют глюкозу как в аэробных условиях — пожелтение среды в пробирках без вазелина (O+), так и в анаэробных — пожелтение среды в пробирках под вазелином (F+). При прочих результатах теста культуру считают не принадлежащей к роду Vibrio и Aeromonas.
6.4. Протеолитические свойства. Исследуемую культуру засевают уколом в столбики желатина в 2 пробирки. Посевы инкубируют при температуре 20 — 22 °C в течение 4 суток. Перед учетом результатов пробирки с посевами вместе с контролем (без посева) помещают на 20 мин в холодильник. Если желатин остается твердым, как в контроле, то результат оценивают как отрицательный. При положительном результате желатин разжижается и остается жидким при выдерживании в холодильнике. Бактерии Vibrio anguillarum разжижают желатин.
6.5. Проба на индол. Индол образуется в результате распада аминокислот под действием микроорганизмов. Испытуемую культуру выращивают на бульоне Хоттингера при температуре 20 — 22 °C в течение 4 суток. В пробирку, содержащую 5 см3 бульонной культуры, вносят 6 капель реактива Ковача, который готовят следующим образом: в 150 см3 растворяют 10,0 г парадиметиламинобензоальдегида, после чего к раствору медленно добавляют 50 см3 концентрированной соляной кислоты. При окрашивании содержимого пробирки в розовый цвет результат пробы оценивают положительно. Если окрашивание не наступило — отрицательно. Бактерии Vibrio anguillarum — за исключением биотипов «B» и «C» — считаются индоположительными.
6.6. Декарбоксилазная активность. Декарбоксилазную активность определяют на жидких питательных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, аргинином), приготовленными по Меллеру (см. приложение № 2, п. 1.4).
Каждый исследуемый штамм засевают в 4 пробирки — соответственно с лизином, орнитином, аргинином и без добавления аминокислоты (контроль). В каждую пробирку засевают по одной полной бактериологической петле культуры. Сразу после засева во все пробирки добавляют стерильное вазелиновое масло. Посевы инкубируют при температуре 20 — 22 °C в течение 6 суток. Изменение цвета среды указывает на декарбоксилазную активность изучаемой культуры.
Бактерии Vibrio anguillarum не декарбоксилируют орнитин и лизин, но проявляют аргининдегидролазную активность.
6.7. Уреазную активность бактерий Vibrio anguillarum определяют на средах с мочевиной. Испытуемую культуру засевают петлей на агар Кристенсена (см. приложение № 2, п. 1.5) и инкубируют при температуре 20 — 22 °C в течение 2 — 4 суток. Расщепление мочевины определяют по изменению цвета среды от желтого к фиолетово-красному. Бактерии Vibrio anguillarum не обладают уреазной активностью и, таким образом, не разлагают мочевину.
6.8. Ферментация углеводов и многоатомных спиртов. В качестве основы для приготовления сред с углеводами используют 1%-ную пептонную воду (pH 7,2 — 7,4) с 1,5% хлористого натрия. В воду добавляют (отдельно) по 1% мальтозы, лактозы, глюкозы, сахарозы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита и в каждую пробирку по 1% индикатора Андраде. Среды в объеме по 2 см разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при температуре 110 — 112 °C (0,5 атм) в течение 20 мин. Результаты роста культур на средах с углеводами учитывают на 4-е сутки после культивирования при температуре 20 — 22 °C. Об образовании кислоты, при расщеплении углеводов и спиртов судят по покраснению (бесцветных) сред, а о газообразовании — по наличию в поплавках пузырьков газа. Бактерии Vibrio anguillarum расщепляют углеводы, за исключением инозита, до кислоты без образования газа.
Результаты изучения культуральных, морфологических и ферментативных свойств используют для дифференциации бактерий Vibrio anguillarum от других бактерий, вызывающих у рыб заболевания со сходными клиническими признаками (таблица 1).
Кроме того, полученные результаты используют для подразделения испытуемых культур на биотипы (таблица 2).
Дифференциально-диагностические свойства бактерий Vibrio anguillarum и бактерий, вызывающих у рыб сходные заболевания
+/- — реакция чаще положительная;
-/+ — реакция чаще отрицательная;
Характеристика биотипов Vibrio anguillarum, выделенных от рыб
| Биотип | Маннит | Сахароза | Индол | Рост на среде без NaCl |
|---|---|---|---|---|
| A | + к | + к | + | - |
| B | - | - | - | - |
| C | + к | + к | - | + |
| D | - | + к | + | - |
| E | - | - | + | - |
7. Серологическое типирование вибрионов проводят в соответствии с действующим Наставлением по применению сыворотки агглютинирующей против Vibrio anguillarum.
Диагноз на вибриоз считается установленным при положительном результате серологической идентификации возбудителя и наличии у рыб клинических признаков и патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни.
8. Серологическую диагностику вибриоза рыб проводят путем исследования сыворотки крови рыб в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) на стекле с диагностикумом, принятым в ветеринарной практике.
При получении положительных результатов исследований и наличии у рыб клинических и патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни, а в случае бессимптомного течения при гибели рыбы, диагноз на вибриоз считается установленным.
Приложение № 2
к Временной инструкции по борьбе с вибриозом рыб от 26 мая 1998 г.
1. Приготовление питательных сред
Основой селективных и элективных питательных сред для культивирования и дифференциации вибрионов является мясо-пептонный бульон (МПБ), в состав которого входят: 50% мясной воды; 1% пептона; 0,5% хлористого натрия; 50% дистиллированной воды.
1.1 Приготовление МПБ.
Мясо крупного рогатого скота, полученное от животных средней упитанности, отделяют от жира, костей и сухожилий, пропускают через мясорубку. Фарш заливают дистиллированной водой из расчета 1:1, доводят до кипения и кипятят в течение 60 мин. После кипячения смесь доводят дистиллированной водой до первоначального объема, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в стеклянные бутыли и стерилизуют при 121 °C (1 атм) в течение 60 мин. Мясную воду готовят впрок, содержание аминного азота в ней составляет 70 — 90 мг%.
К мясной воде, разведенной 1:1 водопроводной водой, прибавляют пептон и хлористый натрий. После их растворения к 20 см3 бульона приливают из бюретки 10%-ный раствор соды или едкого натра до слабощелочной реакции. Соответствующим расчетом определяют количество щелочи, необходимое для подщелачивания оставшейся среды, и это количество щелочи вносят в МПБ. Проверив pH МПБ, его кипятят в течение 30 мин, разливают в емкости и стерилизуют при температуре 121 °C (1 атм) в течение 20 мин.
1.2. Приготовление мясо-пептонного агара (МПА). К 1 литру МПБ прибавляют соответственно 20,0 грамм агара в волокнах или порошке и 7,5 грамм хлористого натрия, нагревают до растворения, устанавливают pH 7,2 — 7,4, осветляют, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр и разливают в пробирки или флаконы. Для определения галофильности вибрионов применяют МПА, к которому перед стерилизацией добавляют 1,5; 3,0; 7,0; 10,0% хлористого натрия. Стерилизуют среду при температуре 121 °C (1 атм) в течение 30 мин. Готовая питательная среда содержит 60 — 70 мг% аминного азота, pH 7,4 — 7,8.
1.3. Приготовление дифференциально-диагностического агара с пенициллином (среда ДДА).
К расплавленному щелочному МПА (pH 8,0 — 8,6), приготовленному из обычного МПА путем добавления 30 см3 10-процентного раствора углекислого натрия и кипячения в течение 45 мин, остуженному до 45 — 50 °C, добавляют по 1,5% хлористого натрия и сахарозы. Устанавливают pH 8,0 — 8,2 и стерилизуют при температуре 110 — 112 °C (0,5 атм) в течение 15 мин. После остывания среды до 45 — 50 °C в нее добавляют 1% бромтимолблау (1,6-процентного спиртового раствора) и пенициллин из расчета 5 ЕД/см3, перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Среду, имеющую сине-зеленый цвет, сохраняют при температуре 4 — 8 °C и используют в течение 2 недель.
1.4. Среда Меллера состоит из пептона 5,0 г, мясной воды (1 кг мяса на 1 литр дистиллированной воды) — 5 см3, бромкрезолпурпура (1,6%) — 0,6 см3, крезолрота (0,2%) — 2,5 см3, D-глюкозы — 0,5 см3, пиридоксина — 5 мг (можно взять витамин B6), дистиллированной воды до 1000 см3. Учитывая галофильность вибрионов, в среду добавляют 1% хлористого натрия и устанавливают pH 6 — 6,2.
Для приготовления среды все компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании, устанавливают pH среды 6,0 и разделяют на четыре части, в три из которых добавляют по одной аминокислоте — соответственно аргинин, орнитин, лизин. Если аминокислоты в L-форме, тогда достаточно 1%, если — в DL-форме — 2%. После добавления аминокислот, перед стерилизацией устанавливают pH 6,2. Среды разливают по 2 — 3 см3 в пробирки и стерилизуют при температуре 121 °C (1 атм) в течение 10 мин.
1.5 Среда с мочевиной (Кристенсена)
В состав среды входит: пептон — 1,0 г; фосфат калия однозамещенный — 2,0 г; хлористый натрий — 5,0 г; глюкоза — 1,0 г; агар — 20,0 г; мочевина — 20,0 г; фенолрот — 0,012 г; дистиллированная вода 1000 см3, pH среды 6,8.
Промытый агар расплавляют в воде при нагревании. Затем в среду вносят пептон, соли, глюкозу, доводят ее до кипения и добавляют фенолрот, предварительно растворенный в растворе едкого натрия. Среду в объеме по 5 см3 разливают в пробирки и стерилизуют при температуре 110 — 112 °C (0,5 атм) в течение 20 мин. После охлаждения среды до температуры 50 °C в каждую пробирку добавляют по 0,5 см3 20%-ного раствора мочевины (20 г мочевины растворяют в дистиллированной воде и кипятят 30 мин на водяной бане). Приготовленную среду скашивают. Цвет среды зеленовато-желтый. При защелачивании цвет среды меняется до красно-фиолетового.