Методические указания по ветеринарно-санитарному контролю качества замороженной спермы быков-производителей с целью ее сертификации

(утв. Минсельхозпродом России 03.11.1999 № 13-2-20/1036)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОМУ КОНТРОЛЮ КАЧЕСТВА ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ С ЦЕЛЬЮ ЕЕ СЕРТИФИКАЦИИ

В целях ветеринарного контроля за качеством спермы быков-производителей проводят санитарную оценку замороженной спермы.

На быков-доноров, от которых отбирают сперму для исследования, должны быть представлены данные о проведенных исследованиях с отрицательными результатами согласно действующих ветеринарно-санитарных правил, утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (1993 г.) на следующие инфекционные болезни: бруцеллез, туберкулез, паратуберкулезный энтерит, лептоспироз, инфекционный ринотрахеит, хламидиозный аборт, лейкоз, трихомоноз, кампилобактериоз.

Сперму исследуют по следующим показателям:

• определение общего количества микроорганизмов — микробное число в 1 куб. см спермы;
• определение Коли-титра в 1 куб. см спермы;
• наличие патогенных и условно патогенных микроорганизмов: энтеропатогенные эшерихии, сальмонеллы, Ps. aeruginosa, Pr. vulgaris, грамотрицательные кокки, Staph. aureus, Str. faecalis, Str. pyogenes, анаэробы;
• наличие патогенных грибов: Asp. fumigatus, Asp. flavus, Asp. niger, Asp. nidulans. Asp. terreus, Asp. vergicolor, Absidia corimbitera, Absidia ramosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Mucor pusillus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rhizopus cohnii, Candida stellatoidea, Candida guilliermond, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida parakrusei.

1. ОТБОР ПРОБ СПЕРМЫ И ДОСТАВКА ИХ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Для исследования отбирают пробы спермы при наличии ветеринарных сопроводительных документов.

1.2. Взятие проб замороженной спермы для ветеринарно-санитарной оценки ее качества необходимо проводить с соблюдением правил асептики, чтобы исключить контаминацию спермы микрофлорой.

1.3. Пробы спермы отбирают комиссионно, с участием представителя госветслужбы, владельца спермы быка-производителя и представителя организации по искусственному осеменению сельхозживотных.

1.4. Пробы отбирают над пламенем спиртовки стерильными пинцетами в сухие стерильные пробирки или флаконы из-под антибиотиков и герметически закрывают стерильными пробками.

1.5. Отобранные пробы спермы помещают в сосуды Дьюара, предварительно продезинфицированные, наполненные жидким азотом не менее 2/3 емкости и обеспечивающие ее хранение в замороженном состоянии на все время транспортировки и хранения до начала исследования, но не менее 20 дней.

1.6. Замороженная сперма быков должна быть отобрана для исследования посерийно.

1.7. Серией замороженной спермы быков считают любое количество доз, полученных от одного производителя из одного или нескольких смешанных эякулятов, изготовленных за один технологический цикл, оформленных одной датой, одним номером и документом.

1.8. Из хранилища формируют среднюю пробу замороженной спермы быка поквартально, в течение года, т.е. по 1 — 2 серии спермы, заготовленной в месяц. От каждой серии отбирают 4 — 8 доз, в зависимости от расфасовки спермы (0,5 — 0,25 куб. см соответственно).

1.9. Пробу замороженной спермы, предназначенную для исследования, маркируют с указанием номеров серии, клички и инвентарного номера быка, дат замораживания спермы.

1.10. К направляемым для исследования пробам спермы прилагается сопроводительный документ, в котором должно быть указано: наименование предприятия-изготовителя, наименование продукции, данные о благополучии предприятия по инфекционным болезням и результаты последнего обследования быков-производителей на вышеперечисленные инфекционные болезни, форма упаковки спермодоз, номера серий и дат замораживания спермы и количество спермодоз в серии, подпись руководителя предприятия и лица, проводившего отбор проб спермы.

2. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ

2.1 Подготовка к исследованиям.

2.1.1. Флаконы или пробирки с замороженной спермой вынимают из жидкого азота и оставляют при комнатной температуре до полного оттаивания проб.

2.1.2. Пайетты, ампулы, облицованные гранулы со спермой перед вскрытием обрабатывают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификатом. Стерильным пинцетом придерживают один конец пайетты, ампулы или облицованной гранулы, а другой конец срезают стерильными ножницами. Размороженную сперму выливают в стерильную сухую пробирку.

2.1.3 Разведения для посевов спермы готовят следующим образом:

к 9,0 куб. см стерильного 0,9% раствора хлористого натрия добавляют 1 куб. см оттаянной спермы. Тщательно перемешивают и готовят десятикратные разведения, в зависимости от степени ожидаемой контаминации спермы, начиная с разведения 1:10.

Каждое разведение спермы проводят с использованием одной пипетки. Раствор набирают с помощью резиновой груши или полиэтиленового баллончика и тщательно (не менее трех раз) промывают пипетку раствором из той пробирки, в которую перенесли суспензию.

2.2. Определение общего числа (микробного числа) микроорганизмов в 1 куб. см спермы.

2.2.1. Сперму, подготовленную по п. 2.1.3 высевают на одну из следующих трех питательных сред: 2% мясопептонный агар с 1% глюкозы и 5% крови барана или крупного рогатого скота; агар Хоттингера или тиогликолевую среду (рецепты сред в приложении 1).

2.2.2. Разбавленную сперму переносят на среды (высевают) стерильной градуированной пипеткой в количестве 1,0 куб. см в чашки Петри (из расчета не менее трех чашек на каждое разведение) и равномерно распределяют материал по всей поверхности агара покачиванием чашек. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37 +/- 0,5 °C и инкубируют в течение 48 часов. Подсчет колоний, выросших на поверхности агара и определение числа микробных тел в 1 куб. см (микробного числа) проводят по ГОСТ 20909.2-75.

2.3 Определение коли-титра.

2.3.1. Разбавленную по п. 2.1.3 сперму в количестве 1 куб. см вносят в пробирку со средой Булира. Посевы выдерживают в термостате при температуре 44 — 45 °C в течение 24 часов. В результате осмотра пробирок устанавливают бродильный титр.

К группе кишечной палочки относят все разновидности кишечной палочки, способные ферментировать жидкую среду, содержащую глюкозу и маннит с выделением кислоты и газа в течение 24 часов инкубации при температуре 45 — 44 °C.

2.3.2. При отсутствии помутнения среды газообразования реакцию считают отрицательной. Изменение цвета среды (пожелтение, помутнение) и газообразование (пузырек в газовке), указывает на наличие в среде микробов из группы кишечной палочки. В этом случае реакцию считают положительной.

2.3.3. При наличии положительной реакции на бродильный титр проводят исследование на идентификацию кишечной палочки по ГОСТ 20909.2-75.

2.3.4. Коли-титром считают наименьший объем исследуемого материала, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Коли-титр выражают степенью разведения: 1:10 — 0,1; 1:100 — 0,01 и т.д.

2.4. Исследование на наличие синегнойной палочки, анаэробной микрофлоры, грибов.

2.4.1. Для выделения синегнойной палочки исследуемый материал высевают на мясопептонный бульон с добавлением 1 — 2% сахара (глюкозы, лактозы) и инкубируют посевы в течение 6 — 7 суток в термостате при температуре 37 +/- 0,5 °C, проверяя рост каждые 1 — 2 дня. При росте микроб продуцирует водорастворимый пигмент пиоцианин, который постепенно окрашивает бульон в зеленовато-голубой цвет. На мясопептонном агаре он дает круглые голубовато-серые колонии. При микроскопии — грамотрицательная палочка. Основной признак культуры синегнойной палочки — положительная хлороформная проба: к 18-часовой культуре добавляют 1,0 мл хлороформа. Культура, давшая положительную реакцию (окраска хлороформа в синий цвет) относится к синегнойной палочке.

2.4.2. Для выделения анаэробных бактерий, помимо соответствующей среды и температурного оптимума, требуется создание бескислородных условий. Лучше всего для выращивания анаэробов применять среду Китт-Тароцци. Исследуемый материал засевают по 1 — 2 капли в 2 пробирки с указанной средой. Одну из пробирок, после посева материала, прогревают в водяной бане при температуре 80 °C в течение 20 минут для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры. Затем засеянные пробирки помещают в термостат при 37 °C на 10 суток. На печеночном бульоне учитывают интенсивность роста, характер осадка, а также наличие и степень газообразования.

Дальнейшую идентификацию проводят по методикам исследования анаэробных микроорганизмов.

2.4.3. Для исследования на наличие грибов, чашки с высевами спермы на мясопептонном агаре после подсчета количества микробных тел оставляют при комнатной температуре на 8 — 10 суток в месте, удаленном от прямых солнечных лучей. По истечении этого срока, чашки с посевами проверяют на наличие в них роста грибов. Идентифицирование выросших грибов проводят по «Методике микологического исследования и оценки спермы, применяемой при искусственном осеменении с/х животных» утвержденной ГУВ МСХ СССР 2.01.78 г.

2.5 Идентификация выделенных микроорганизмов

2.5.1. Чашки с первичными посевами спермы, после учета числа выросших на них микроорганизмов, используют для выделения чистых культур (изолятов) и последующей их идентификацией.

2.5.2. Изучают визуально морфологию колоний микроорганизмов, выросших на чашках с питательными средами: размер, форму поверхность, цвет.

2.5.3. Из колоний, выросших на питательной среде, готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют и делят микроорганизмы, в зависимости от окраски на грамположительные и грамотрицательные.

2.5.4. Для выделения чистой культуры, изолированную колонию одного вида или часть ее бактериологической петлей над пламенем горелки переносят в пробирки с мясопептонным бульоном (МПБ) и на поверхность скошенного мясопептонного агара (МПА) штрихом. Посевы инкубируют при температуре 37,5 — 0,5 °C 24 — 48 часов.

2.5.5. Выделение чистой культуры необходимо для изучения культуральных и ферментативных признаков, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроба.

2.5.6. Изучение морфологических и культуральных свойств микро-ов. В посевах на МПА отмечают наличие пигмента и другие морфологические особенности. В посевах на МПБ отмечают рост бактерий с равномерным помутнением среды, придонный рост с образованием осадка на дне (скудным или обильным, крошковатым или хлопьевидным), образование пигмента, наличие на поверхности бульона пленки или пристеночного кольца.

2.5.7. При изучении ферментативных свойств определяют наличие протеолитических ферментов, сахаролитических и других свойств.

Для этого исследуемую культуру высевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды.

2.6 Определение патогенности выделенных микроорганизмов.

2.6.1. Патогенность микробов определяют по гемолитическим, плазмокоагулирующим свойствам и биопробе — способности убивать белых мышей.

2.6.2. Гемолитические свойства способность микробов гемолизировать эритроциты крови определяют на чашках Петри с кровяным агаром. Для этого изолированную культуру микроба высевают на поверхность МПА, содержащего 5% крови. Посевы инкубируют при температуре 37 +/- 0,5 °C в течение 48 часов. При наличии вокруг выросших колоний зон гемолиза альфа или бетта — реакцию считают положительной.

2.6.3. Плазмокоагуляция — способность патогенных микробов (преимущественно стафилококков) свертывать цитратную плазму крови кролика. Реакцию плазмокоагуляции проводят с использованием сухой стандартной плазмы кролика, в соответствии с общепринятой методикой исследований.

Для постановки реакции берут 0,5 куб. см плазмы, разведенной 1:5, которую переносят в стерильную пробирку и добавляют 18 — 20-часовую агаровую культуру изолята (культуру берут бактериологической петлей).

Пробирки помещают в термостат при 37,5 +/- 0,5 °C и проверяют наличие свертывания плазмы через 1, 2, 5, 18 и 24 часа.

Патогенные микробы продуцируют фермент плазмокоагулазу, который свертывает плазму. Реакция считается положительной независимо от времени свертывания плазмы и вязкости сгустка.

3. САНИТАРНАЯ ОЦЕНКА ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ

3.1. Замороженную сперму считают пригодной для искусственного осеменения, если она получена от клинически здоровых быков-доноров и в ней не содержатся патогенные и условно патогенные микроорганизмы.

3.2. В замороженной сперме допускается содержание непатогенных микроорганизмов (не вызывающих гемолиз, плазмокоагуляцию, гибель мышей и не проявляющих рост в присутствии санирующих веществ в терапевтических дозах) до 500 м.т. в 1 куб. см, а коли-титр — выше 0,1 куб. см т.е. отрицательный.

3.3. При получении удовлетворительных результатов, соответствующих пп. 3.1 и 3.2 выдается ветеринарный сертификат на замороженную сперму, исследованную в течение года от каждого быка для ее использования при искусственном осеменении коров.

3.4. В случае использования спермы от быка, находящегося на племпредприятии исследование спермы от него проводят ежемесячно; к результатам по исследованию спермы прилагают ветеринарный паспорт о благополучии быка по инфекционным болезням.

Настоящие Методические указания разработаны Всероссийским НИИ контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратов и специалистами Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ.

ПАСПОРТ НА СПЕРМУ БЫКА

1. Название и адрес организации-владельца быка-производителя

---

2. Сведения о быке-производителе: порода ____________________________________________________________________ дата и место рождения _____________________________________________________ дата начала использования производителя ___________________________________

3. Данные о сперме: дата получения эякулята и способ замораживания ____________________________

---

                        (пайетты, гранулы)

4. Степень разбавления спермы; наличие санирующих препаратов, концентрация на 100 куб. см среды, состав среды: _______________________________________

---

5. Количество серий и доз замороженной спермы _____________________________

6. Бык-производитель, от которого получена сперма, здоров и находится в хозяйстве, свободном в течение 12 месяцев от инфекционных болезней крупного

рогатого  скота:  туберкулеза,  паратуберкулеза,  бруцеллеза, лептоспироза,
лейкоза,   инфекционного   ринотрахеита,   хламидиоза  кампилобактериоза  и

трихомоноза.

7. Поголовье быков-производителей, где получена и заморожена сперма, находится под постоянным ветеринарным контролем и подвергается: исследованиям на туберкулез, бруцеллез, лептоспироз, лейкоз, трихомоноз и кампилобактериоз — два раза в год;

исследованиям  на инфекционный  ринотрахеит - ИРТ  (кроме вакцинированных),
хламидиоз,  паратуберкулезный  энтерит  - один раз  в год  с отрицательными
результатами;  содержание,  взятие и замораживание от них спермы проводится

с соблюдением ветеринарно-санитарных требований.

Главный ветврач организации    (подпись)
Главный технолог организации   (подпись)

Приложение к ветеринарному сертификату

Бык-производитель _________________________________________________________ (кличка, инвентарный номер) исследован на следующие заболевания:

1. Туберкулез _____________________________________________________________ (дата, метод и результаты исследований)

2. Паратуберкулез _________________________________________________________

3. Бруцеллез ______________________________________________________________

4. Лептоспироз ____________________________________________________________

5. Кампилобактериоз _______________________________________________________

6. Трихомоноз _____________________________________________________________

7. Лейкоз _________________________________________________________________

8. Инфекционный ринотрахеит _______________________________________________

9. Хламидиоз ______________________________________________________________

10. Состав среды для замораживания спермы, санирующие препараты, дозы _____

---

11. Количество доз ________________________________________________________

12. Дата отправки замороженной спермы _____________________________________

13. Температура хранения отправляемой замороженной спермы _________________ Ветеринарный сертификат выдан _______ число ____ месяц _________ год.

Главный ветеринарный врач ______________________ (название организации) ______________________ (фамилия, инициалы) Главный технолог ______________________ (фамилия, инициалы)

1. 2% МПА с 1% глюкозы и 5% крови барана:

мясопептонного бульона — 1,0 мл

агара — 20,0 мл

глюкозы — 10,0 г

цитрированной крови барана — 50,0 мл

2. Тиогликолевая среда:

дистиллированной воды — 1,0 л

панкреатического гидролизата казеина — 15,0 г

экстракта дрожжей — 5,0 г

хлорида натрия — 2,5 г

глюкозы — 5,0 г

цистина — 0,75 г

тиогликолевой кислоты или тиогликолята натрия — 0,3 мл

агара — 20,0 г

3. Среда Хоттингера:

водопроводной воды — 800 мл

перевара Хоттингера — 200 мл

хлористого натрия — 0,4 г

агара — 2,5 г

4. Среда Булира:

мясопептонного бульона — 100 мл

маннита — 250 мг

насыщенный водный раствор нейтральрота — до окрашивания смеси в вишнево-красный цвет

---