Методические указания по лабораторной диагностике вирусного энтерита гусят

(утв. Минсельхозом СССР 25.12.1980 № 115-6а)

Утверждены Министерством сельского хозяйства СССР 25 декабря 1980 г. № 115-6а

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ГУСЯТ

1. Общие положения.

1.1. Лабораторная диагностика вирусного энтерита гусят заключается: в выделении вируса в гусиных эмбрионах (ГЭ) или культуре клеток гусиных фибробластов (ГФ); в идентификации вируса в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток ГФ или в реакции диффузионной преципитации (РДП).

1.2. Диагноз на вирусный энтерит гусят устанавливают на основании результатов лабораторного исследования, эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений.

1.3. Для постановки диагноза с учетом выделения вируса и его идентификации в РДП и РН требуется 14 ... 22 дня.

2. Отбор и подготовка материала.

2.1. В ветеринарную лабораторию направляют 5 ... 6 свежих трупов гусят, помещенных в целлофановые пакеты и термос со льдом. В лаборатории при вскрытии гусят отбирают кусочки печени, селезенки, почек, головного мозга, сердца, а также носовую слизь и кусочки двенадцатиперстной кишки (последние помещают в отдельную посуду).

2.2. Кусочки внутренних органов растирают в ступке и готовят из них 10%-ную суспензию на физиологическом растворе. Суспензию центрифугируют при 1 ... 3 тыс. об/мин 10 ... 15 мин. После этого надосадочную жидкость отсасывают пипеткой в пробирку, в которую добавляют 200 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, затем выдерживают эту смесь 30 ... 40 мин при комнатной температуре и делают посевы на МПА, МПБ и среду Китта-Тароцци.

При использовании внутренних органов, носовой слизи и кишечника для выделения вируса суспензию фильтруют через фильтр Зейтца СФ или добавляют к ней равный объем х.ч. хлороформа, затем шуттелируют и центрифугируют при 3 тыс. об/мин по 15 мин. Для заражения ГЭ берут фильтрат или надосадочную жидкость.

3. Выделение вируса в ГЭ.

3.1. Для выделения вируса используют ГЭ из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням гусей.

3.2. Фильтрат или жидкость, обработанную антибиотиками или хлороформом, вводят не менее 6 ГЭ 10 ... 12-дневного возраста и одновременно для исключения других вирусов (ньюкаслской болезни, вируса гепатита, реовирусов) 6 куриным эмбрионам (КЭ) 8 ... 9-дневной инкубации. Эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,5 °C, затем их овоскопируют ежедневно и отбирают павших.

В положительном случае у павших на 3 ... 4-е сут ГЭ обнаруживают гиперемию, кровоизлияния в коже, отек тельца, у павших через 5 сут и более — отставание в росте, отек затылочной части головы, подчелюстного пространства, шеи, гиперемию крыльев, гиперемию и отек конечностей, у некоторых — кровоизлияние в мозг, дистрофию сердечной мышцы, уплотнение печени, увеличение и гиперемию почек.

Возбудитель вирусного энтерита гусей не вызывает гибели КЭ.

3.3. Вируссодержащую амнионаллантоисную жидкость павших ГЭ контролируют в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами кур. Вирус энтерита гусят не агглютинирует их.

3.4. Для исключения коли-паратифозной микрофлоры, которая может вызвать гибель зараженных ГЭ в первые дни, амнионаллантоисную жидкость исследуют бактериологически.

4. Идентификация вируса в РН.

4.1. Испытуемый вируссодержащий материал (суспензию из кусочков органов с антибиотиками, фильтрат или вируссодержащую амнионаллантоисную жидкость ГЭ) вносят на монослой ГФ или суспензию их, полученных путем трипсинизации ГЭ 14-дневной инкубации.

Зараженные ГФ инкубируют в термостате при температуре 37,5 °C в течение 7 сут с ежедневным просмотром под малым увеличением микроскопа. В положительном случае на 5 ... 6-й день наступает ЦПД в виде округления клеток и отторжения их от стекла. В отдельных случаях проводят 2 ... 3 слепых пассажа.

4.2. Адаптированный к культуре ГФ вирус идентифицируют в РН по методу: постоянная доза вируса 1000 ТЦД50 + двукратные разведения специфической сыворотки кролика против вируса энтерита гусят.

4.3. Для постановки РН необходимы следующие компоненты: испытуемый вирус, адаптированный в культуре ГФ (антиген); специфическая кроличья сыворотка; нормальная кроличья сыворотка.

4.4. Перед постановкой реакции нейтрализации определяют титр вируса (ТЦД50), для чего каждым его десятикратным разведением в объеме 0,1 мл заражают по 4 пробирки монослоя ГФ и инкубируют его в термостате при температуре 37,5 °C в течение 5 ... 7 сут. Титр вируса вычисляют по методу Рида и Менча.

Специфическую и нормальную кроличьи сыворотки инактивируют на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин, а затем из каждой готовят двукратные разведения 1:5, 1:10, 1:20 на 0,5%-ном растворе гидролизата лактальбумина. В качестве антигена в каждую пробирку вносят вирус, содержащий 2·10-3 ТЦД50/мл, чтобы в смеси с сывороткой находилось 10-3 ТЦД50/мл.

После добавления вируса в равном объеме к разведению сыворотки смесь встряхивают и на 1 ч ставят в термостат при температуре 37,5 °C, после чего каждой смесью по 0,2 мл заражают по 4 пробирки монослоя ГФ или суспензию клеток и инкубируют их при температуре 37,5 °C.

4.5. Для оценки РН ежедневно проводят микроскопию зараженной культуры под малым увеличением микроскопа. О положительном результате свидетельствует отсутствие ЦПД на 5 ... 6-й день в пробирках со специфической сывороткой в разведениях 1:10 и более и наличие ЦПД с нормальной сывороткой в разведении 1:10.

5. Идентификация вируса в РДП.

5.1. Для обнаружения и идентификации вируса в РДП требуются следующие компоненты: 1%-ный агар на 0,8%-ном растворе хлористого натра; специфическая кроличья сыворотка к вирусу энтерита гусят; исследуемый материал — амнионаллантоисная жидкость павших ГЭ после их заражения, суспензия из кусочков внутренних органов больных или павших гусят или эта же суспензия, обработанная хлороформом; нормальная кроличья сыворотка; амнионаллантоисная жидкость незараженных гусиных эмбрионов или суспензия из кусочков органов здоровых гусят.

5.2. Агаровую среду готовят по прописи: агар «Дифко» — 1 г, хлористый натрий — 8 г, вода дистиллированная — 100 мл. Смесь автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, затем фильтруют через 2 слоя марли и доводят pH смеси до 7,2 ... 7,4 10%-ным раствором едкого натра. Среду консервируют мертиолятом (0,01% к общему объему) и хранят при температуре 4 °C 12 ... 14 сут.

Перед постановкой реакции агар расплавляют и разливают тонким слоем (2 ... 3 мм) в чашки Петри или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки.

5.3. Постановку реакции осуществляют следующим образом: в центральную лунку вносят 0,2 мл специфической кроличьей сыворотки против вирусного энтерита гусей, а в периферические — через одну по 0,2 мл исследуемые суспензии из тканей органов (необработанные или обработанные хлороформом) или амнионаллантоисные жидкости павших гусиных эмбрионов.

В качестве контроля служат специфическая кроличья сыворотка против вирусного энтерита гусей с отрицательным антигеном амнионаллантоисной жидкости незараженных гусиных эмбрионов или суспензией из тканей органов здоровых гусят и испытуемый вируссодержащий материал с нормальной кроличьей сывороткой.

5.4. Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру и выдерживают 18 ... 24 ч при температуре 37,5 °C.

5.5 Учет реакции производят через 18 ... 24 ч.

Реакцию считают положительной при наличии четко выраженных полос преципитации между лунками с испытуемым антигеном и специфической сывороткой и отсутствии полос между специфической сывороткой и антигеном из амнионаллантоисной жидкости незараженных гусиных эмбрионов или суспензии органов здоровых гусят и между испытуемым материалом с нормальной кроличьей сывороткой (1).

---