---
title: "\"Методические указания по лабораторной диагностике болезни Марека (нейролимфоматоза) птиц\""
number: "115-6а"
issuer: "Министерство сельского хозяйства СССР"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/115-6a-minselhoz-sssr-ministerstvo-6"
---
## "Методические указания по лабораторной диагностике болезни Марека (нейролимфоматоза) птиц"
# "Методические указания по лабораторной диагностике болезни Марека (нейролимфоматоза) птиц"
(утв. Минсельхозом СССР 01.03.1979 N 115-6а)
> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).
Утверждены
Министерством сельского
хозяйства СССР
1 марта 1979 г. N 115-6а
**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ МАРЕКА**
**(НЕЙРОЛИМФОМАТОЗА) ПТИЦ**
## 1. Общие положения.
1.1. Лабораторная диагностика болезни Марека заключается в: обнаружении антигена в эпителии перьевых фолликулов в реакции диффузионной преципитации (РДП); выявлении антител в сыворотке крови в РДП; обнаружении гистологических и цитологических изменений в органах и тканях.
При необходимости вирус болезни Марека выделяют на развивающихся эмбрионах кур (РЭК) и чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией его в РДП и определением патогенности вируса на суточных цыплятах.
## 2. Отбор и подготовка материала.
2.1. В ветеринарную лабораторию направляют 5 ... 10 живых, клинически больных цыплят, от которых берут кровь, а при вскрытии - патологический материал (кусочки пораженных органов, кожи, мышц, периферических нервов - плечевого, крестцово-седалищного сплетения, фабрициеву сумку, тимус). Патологический материал используют для вирусологических (не позднее 2 ... 3 ч после взятия) и патоморфологических исследований. Кроме того, от больных цыплят берут перья, как указано в [п. 2.3](#p100010), для обнаружения вирусного антигена.
2.2. Из цельной крови после отстаивания отделяют сыворотку, которую исследуют в РДП. Часть крови стабилизируют добавлением 15 ... 20 ЕД/мл гепарина или 5%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 и используют для заражения цыплят и РЭК.
2.2.1. Пораженные опухолями печень, почки, селезенку растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса, среде Игла или физиологическом растворе. К суспензии добавляют по 1000 ЕД/мл пенициллина, стрептомицина, 40 ... 50 ЕД/мл нистатина и выдерживают при 4 °C в холодильнике в течение 40 ... 60 мин. Если опухоли во внутренних органах больных птиц визуально не обнаруживаются, то для заражения используют только стабилизированную кровь.
**2.3. Для выявления антигена болезни Марека от каждой исследуемой птицы с наружной поверхности бедра выщипывают по 10 ... 15 перьев с наличием производящей ткани (эпителия перьевых фолликулов) внутри очина. Очины пера измельчают ножницами на кусочки по 1 ... 2 мм, затем их растирают в ступке или гомогенизаторе. Полученную массу заливают физиологическим раствором 1:10, 3 раза замораживают и оттаивают, после чего выдерживают сутки при 4 °C. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого антигена.**
## 3. Обнаружение вирусного антигена в эпителии перьевых фолликулов и антител в сыворотке крови в реакции диффузионной преципитации.
3.1. В РДП исследуют не менее 10 проб сывороток крови птиц и 10 антигенов (проб пера) от цыплят 30 ... 150-дневного возраста и взрослой птицы.
#### 3.2 РДП ставят в агаровом геле.
3.3. Компоненты реакции: специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка; специфический антиген; контрольный отрицательный антиген; испытуемый материал.
3.4. Агаровую среду готовят по прописи: агар "Дифко" - 1 г, хлористый натрий - 8 г, вода дистиллированная - 100 мл. Смесь автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, затем фильтруют через два слоя марли и доводят pH смеси до 7,2 ... 7,4 10%-ным раствором едкого натра. Среду консервируют мертиолятом (0,01% к общему объему) и хранят при температуре 4 °C 12 ... 14 сут.
Перед постановкой реакции агар расплавляют и разливают тонким слоем в чашки Петри или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки.
#### 3.5 Постановка реакции.
3.5.1. Для идентификации антигена в центральные лунки вносят специфическую сыворотку, а в периферические - испытуемый антиген.
Контроли: 1) специфический антиген + специфическая сыворотка; 2) специфический антиген + отрицательная сыворотка.
3.5.2. Для выявления антител в сыворотке крови в центральную лунку вносят специфический антиген, а в периферические - исследуемые сыворотки.
3.5.3. Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают сутки при температуре 37 °C, затем - сутки при комнатной.
3.6. Учет реакции. Результаты реакции учитывают предварительно через 24 ... 48 ч и окончательно - через 72 ч.
**Реакцию считают положительной при наличии четко выраженных полос преципитации между лунками с испытуемым антигеном и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с отрицательной сывороткой.**
## 4. Гистологический и цитологический методы диагностики.
4.1. Для гистологического исследования кусочки пораженных внутренних органов фиксируют в 10 ... 15%-ном растворе нейтрального формалина (1:20). Гистологические препараты готовят из целлоидиновых или парафиновых срезов, которые после обработки окрашивают гематоксилин-эозином.
4.2. Для цитологического исследования готовят мазки-отпечатки из пораженных органов. Препараты фиксируют метанолом и окрашивают краской Лейшмана или Мая-Грюнвальда дополнительной окраской по Романовскому-Гимза. Препараты просматривают под световым микроскопом.
**4.3. Характерным диагностическим признаком для болезни Марека считают наличие очагово-диффузных инфильтративно-гиперпластических процессов в периферических нервах, внутренних органах, поперечнополосатой мускулатуре и коже. Характерен полиморфноклеточный состав инфильтратов, в которых преобладают лимфоидные, в меньшем количестве - бластные клетки, большое количество недифференцированных крупных опухолевых клеток.**
## 5. Выделение вируса на РЭК.
5.1. Для заражения используют куриные эмбрионы из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц, где не проводят вакцинацию цыплят против болезни Марека.
5.2. Заражают одновременно в дозе 0,2 мл 10 ... 15 4 ... 5-дневных РЭК в желток и 10 ... 15 10-дневных эмбрионов на хорионаллантоисную оболочку.
5.2.1. Для заражения РЭК в желточный мешок используют смесь из равных частей стабилизированной крови и 10%-ной суспензии внутренних органов (см. [п. 2.2](#p100008)).
5.2.2. Для заражения РЭК на хорионаллантоисную оболочку используют клеточно-свободный вирус, который получают двумя способами:
1-й способ - пробы пера (10 ... 15 очинов) погружают в стерильные пенициллиновые флакончики или пробирки с бидистиллированной водой, содержащей пенициллин и стрептомицин по 1000 ЕД/мл и нистатин 50 ЕД/мл. Через 30 мин содержимое очинов пинцетом выдавливают в ступку, тщательно растирают и добавляют 10 ... 12 мл физиологического раствора;
2-й способ - очины пера измельчают ножницами на кусочки по 1 ... 2 мм, заливают физиологическим раствором 1:10, содержащим антибиотики (в указанных выше дозах), и затем обрабатывают ультразвуком на аппарате УЗДН-1 или МЗЕ 4 раза по 30 с с 2-минутными интервалами при частоте 4 ... 6 А.
Полученную любым из указанных способов суспензию клеток (или клеточный детрит) центрифугируют 20 мин при 3 тыс. об/мин; надосадочный слой используют для заражения РЭК на хорионаллантоисную оболочку.
5.3. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,5 °C и дважды в день овоскопируют.
РЭК, зараженные в желток, инкубируют в течение 13 ... 14 сут. Гибель зародышей считается специфической с 8 ... 9-го дня инкубации.
Эмбрионы, зараженные на хорионаллантоисную оболочку, инкубируют в течение 7 ... 8 сут. Гибель их считают специфической через 72 ч после заражения.
Признаком инфицирования эмбрионов вирусом болезни Марека считают их гибель и образование на хорионаллантоисной оболочке серовато-белых пролиферативных очажков-бляшек размером до 1 ... 3 мм в диаметре, увеличение селезенки и печени эмбриона.
5.4. Для учета очажков-бляшек хорионаллантоисную оболочку помещают в чашку Петри, наполненную физиологическим раствором, несколько раз отмывают, расправляют и просматривают с помощью лупы на титропляторе или под микроскопом.
Микро- и макроскопические бляшки и количество их на оболочке могут варьировать в зависимости от чувствительности куриных эмбрионов к вирусу болезни Марека и вирулентности штамма возбудителя.
**5.5. Специфичность изменений подтверждают исследованием материала от зараженных эмбрионов в реакции диффузионной преципитации. Для этого собирают пораженные участки хорионаллантоисной оболочки и экстраэмбриональную жидкость. Хорионаллантоисные оболочки растирают в ступке с песком или измельчают в гомогенизаторе, добавляют физиологический раствор в объеме 1:3 и центрифугируют. Надосадочную жидкость соединяют с экстраэмбриональной жидкостью и концентрируют в 20 раз выпариванием в токе воздуха от вентилятора. Полученный концентрат используют в качестве антигена в РДП, как указано в [п. 3](#p100011) настоящих методических указаний.**
## 6. Биопроба на цыплятах.
6.1. Биопробу на цыплятах проводят с целью определения патогенности возбудителя, дифференциации заболевания от некоторых форм гиповитаминозов, лейкоза, а также при экспериментальном изучении болезни Марека.
Цыплят получают из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц, где не проводится вакцинация против болезни Марека.
6.2. Тридцать однодневных цыплят заражают двукратно с интервалом в 2 дня по 0,3 ... 0,4 мл внутрибрюшинно материалом, приготовленным, как указано в [п. 2.2.1](#p100009). В контроле одновременно содержат в аналогичных условиях 10 ... 15 незараженных цыплят такого же возраста.
6.3. За птицей ведут ежедневное наблюдение в течение 85 ... 90 сут при диагностике острой формы болезни Марека и до 120 сут - классической формы.
6.4. Оценку результатов биопробы проводят по комплексу признаков, учитывая клиническое проявление болезни у зараженных цыплят, наличие вирусспецифического антигена в эпителии перьевых фолликулов, специфических микроскопических изменений в тканях (через 3 ... 8 нед.), опухолевых поражений в органах и специфических изменений в нервах через 1 ... 4 мес.
## 7. Выделение вируса на культуре клеток.
7.1. Для выделения вируса болезни Марека из патологического материала используют 24 ... 48-часовую культуру первично трипсинизированных куриных фибробластов или 72-часовую культуру почек куриных эмбрионов или цыплят, которых готовят общепринятым методом и выращивают в стеклянных флаконах (матрасах) со смещенным горлом.
В качестве питательной среды для культивирования клеток используют гидролизат лактальбумина, среду Игла или Эрла, или среду N 199. В ростовую среду добавляют 10% сыворотки крупного рогатого скота, в поддерживающую - 2%.
7.2. Культуру клеток заражают материалом, приготовленным, как указано в [п. 2.2.1](#p100009), или 10%-ной суспензией из клеток почек от больной птицы. Суспензию готовят по следующей методике: из почек вырезают кусочки размером 2 ... 3 мм, дважды отмывают раствором Хенкса, вносят в колбу и заливают 0,25%-ным раствором трипсина в объеме 1:10. Колбу помещают на магнитную мешалку, суспензию перемешивают в течение 20 ... 30 мин при комнатной температуре. Затем клеточную взвесь фильтруют через 2 слоя марли и центрифугируют при 1 тыс. об/мин в течение 10 ... 15 мин. Осадок ресуспензируют в культуральной питательной среде из расчета, чтобы в 1 мл взвеси было 3 ... 4 млн клеток. В суспензию добавляют по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина и 40 ... 50 ЕД нистатина на 1 мл суспензии, выдерживают в холодильнике в течение 30 ... 60 мин при температуре 4 °C, после чего используют для заражения.
7.3. Перед заражением из матраса (флакона) удаляют ростовую среду и на сформированный монослой клеток вносят исследуемый материал в дозе по 3 мл на флакон размером 4 x 5 см.
После контакта в термостате в течение 30 мин клетки заливают поддерживающей средой и продолжают инкубировать. По мере закисления (изменение цвета среды, величины pH) поддерживающую среду заменяют.
7.4. На 7 ... 8-й день проводят второй пассаж вируса. Для этого поддерживающую среду осторожно удаляют, вносят на монослой одного матраса 1 ... 2 мл подогретого до 30 ... 37 °C 0,125%-ного раствора трипсина и оставляют на контакте при комнатной температуре в течение 2 ... 3 мин. Затем трипсин полностью сливают, а в матрас вносят питательную среду и путем энергичного встряхивания клетки отслаивают от стекла. Полученной суспензией клеток заражают свежий монослой из расчета 1:3, т.е. вирусом, собранным с одного флакона, можно заразить монослой 3 флаконов (из расчета 3 ... 4 млн вируссодержащих клеток на монослой 1 флакона). После контакта в течение 30 мин клетки заливают поддерживающей средой и продолжают инкубировать 48 ... 72 ч.
Через 6 ... 7 сут проводят третий пассаж вируса по такой же методике.
7.5. Учет результатов пассажей ведут по характеру цитопатогенного действия (ЦПД) вируса, имея в виду, что вирус болезни Марека вызывает цитопатические изменения монослоя в виде фокусов, состоящих из скопления округлых рефрактильных клеток, синцитиев и микроскопически видимых бляшек - негативных пятен.
Сроки наступления ЦПД зависят от дозы вируса и количества пассажей. При первичном выделении возбудителя специфические морфологические изменения клеток обычно проявляются во втором-третьем пассажах вируссодержащего материала через 48 ... 96 ч. Специфичность ЦПД подтверждается путем исследования отдельных проб материала в РДП.
7.6. В качестве антигена для РДП используется культуральная жидкость, сконцентрированная в 20 ... 50 раз диализом против глицерина или сахарозы в целлофановых мешочках.
## 8. Сроки установления диагноза.
8.1. По данным лабораторного исследования, диагноз на болезнь Марека ставят через 4 дня по результатам РДП и цитологического метода и через 14 сут - по результатам гистологического исследования [(1)](https://bukva.ai/docs/115-6a-minselhoz-sssr-ministerstvo-8#p100200).
---