Временные методические указания по диагностике парагриппа-3 крупного рогатого скота методом выявления секреторных антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

(утв. Минсельхозом СССР 17.10.1985 № 115-6а)

17 октября 1985 г. № 115-6а

ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)

1. Общие положения.

1.1. Для проведения исследований на парагрипп-3 крупного рогатого скота методом выявления секреторных антител в РТГА отбирают парные пробы носовых секретов от 8...10 животных, которые берут при появлении клинических признаков заболевания (повышение температуры тела, истечения из носовой полости, кашель и др.) и через 6...8 дней.

1.2. Для получения носовых секретов у крупного рогатого скота используют стерильные поролоновые тампоны диаметром 15 мм и длиной 80...90 мм с привязанной с одного конца хлопчатобумажной нитью длиной 250...300 мм. Тампоны закладывают по одному в оба носовых хода на 2...3 мин. После извлечения их помещают в стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию.

1.3. В лаборатории тампоны отжимают при помощи шприцев и до исследования пробы хранят при температуре -12...-20 °C. Допускается хранение проб носовых секретов в течение 20...30 дней (полученные носовые секреты могут быть использованы для выделения вирусов на культуре клеток).

1.4. Перед постановкой РТГА носовые секреты размораживают и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Затем в центрифужные пробирки отбирают по 0,2 мл надосадочной жидкости, добавляют по 0,2 мл 20%-ной суспензии эритроцитов морской свинки, смесь встряхивают, оставляют на 30 мин при 4 °C, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость в объеме 0,3 мл переносят в другую пробирку, в которую добавляют 0,3 мл 25%-ной суспензии каолина на физиологическом растворе. Смесь интенсивно встряхивают в течение 25 мин. Затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин и надосадочную жидкость используют для постановки РТГА.

2. Постановка реакции.

2.1. Для постановки реакции используют антиген, выпускаемый биологической промышленностью в наборе для диагностики парагриппа-3 крупного рогатого скота.

2.2. Перед постановкой РТГА определяют титр антигена. Для этого в лунки панелей разливают по 0,2 мл физиологического раствора pH 7,2. В первую лунку вносят 0,2 мл антигена, перемешивают и переносят по 0,2 мл в последующие 10...12 лунок, делая таким образом ряд двукратных последовательных разведений (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.). Затем во все лунки добавляют по 0,2 мл физиологического раствора и по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки. Одновременно ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию.

Для этого в две лунки наливают по 0,4 мл физиологического раствора и добавляют по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки. Панель встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1...1,5 ч.

За титр антигена принимают его наивысшее разведение, дающее четкую гемагглютинацию (зонтик), что составляет 1 АЕ.

2.3. Для постановки РТГА используют рабочую дозу антигена, которая должна содержать в 0,2 мл 4 АЕ.

Поэтому показатель последнего разведения антигена, вызвавшего агглютинацию, делят на 4. Например: если гемагглютинирующий титр антигена равен 1:256, то рабочее разведение его (4 АЕ в 0,2 мл) будет соответствовать 1:64 (256 : 4 = 64). Следовательно, антиген необходимо развести в 64 раза, то есть к 1 мл антигена добавить 63 мл физиологического раствора.

Для контроля рабочей дозы антигена в четыре лунки панели разливают по 0,2 мл физиологического раствора. В первую лунку вносят 0,2 мл рабочей дозы антигена, затем последовательно делают двукратные разведения. Во все лунки добавляют по 0,2 мл физиологического раствора и по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки. При правильном выборе рабочей дозы антигена в первой и второй лунках должна быть полная агглютинация эритроцитов (2 АЕ и 1 АЕ), а в третьей и четвертой лунках агглютинации быть не должно.

2.4. Реакцию торможения гемагглютинации ставят в объеме 0,4 мл с 4 АЕ парагриппозного антигена.

С этой целью в лунки панели разливают по 0,2 мл физиологического раствора pH 7,2. Затем в первую лунку (контроль на спонтанную агглютинацию) и во вторую вносят по 0,2 мл надосадочной жидкости, приготовленной по п. 1.4. Затем после перемешивания 0,2 мл из второй лунки переносят в третью и т.д., готовя последовательно двукратные разведения 1:8 до 1:1024. Контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию ставят в последней лунке каждого ряда (0,4 мл физиологического раствора и одна капля 5%-ной суспензии эритроцитов морской свинки). Затем во все лунки, кроме первой и последней, добавляют по 0,2 мл антигена, содержащего 4 АЕ, встряхивают панель и оставляют на один час при комнатной температуре.

После контакта в лунки разливают по одной капле 5%-ной суспензии эритроцитов морской свинки, панель снова встряхивают и оставляют при комнатной температуре.

3. Учет реакции.

3.1. Реакцию учитывают через 1...1,5 ч по форме осадка эритроцитов. За титр секреторных антител принимают последнее разведение носовых секретов, где осадок эритроцитов имеет форму точки или колечка.

3.2. Положительным результатом исследования на парагрипп-3 считают выявление антител во второй пробе носовых секретов в титре 1:16 и выше (при отсутствии титров антител в первой пробе) или установление четырехкратного и более увеличения титра антител во второй пробе по сравнению с первой пробой носовых секретов.

Методические указания разработаны в дополнение к действующим Методическим указаниям по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота, рекомендованным Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 июля 1978 г.

---