Методические указания по лабораторной диагностике энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней

(утв. Минсельхозом СССР 01.11.1985 № 115-6а)

Утверждены 1 ноября 1985 г. № 115-6а

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЭНЗООТИЧЕСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА (БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА) СВИНЕЙ

1. Общие положения.

1.1. Лабораторные диагностические исследования на энзоотический энцефаломиелит (болезнь Тешена) свиней включают в себя следующее: обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках из патологического материала методом прямой иммунофлуоресценции (ИФ); выделение вируса в культуре клеток и идентификация его методом ИФ или в реакции нейтрализации (РН); выявление типоспецифических антител в сыворотках крови больных или переболевших животных в РН; биопробу на поросятах 2...4-месячного возраста (в необходимых случаях).

1.2. Для проведения диагностических исследований используется набор диагностикумов болезни Тешена свиней, состоящий из антигена, специфической сыворотки и флуоресцирующего иммуноглобулина.

1.3. Предварительный диагноз на энзоотический энцефаломиелит свиней ставят на основании получения положительного результата по одному из методов, указанных в п. 1.1. Окончательный диагноз устанавливают на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют кусочки мозжечка, продолговатого и спинного мозга от павших или вынужденно убитых в стадии паралича больных животных. Патологический материал доставляют в термосе со льдом (допускается использование сухого льда) или консервированным 30%-ным раствором глицерина, приготовленным на фосфатно-буферном растворе pH 7,2.

2. Метод иммунофлуоресценции.

2.1. Для исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки из свежего или свежезамороженного патологического материала (мозжечка, продолговатого и спинного мозга).

2.2. Препараты высушивают на воздухе 20...30 мин, фиксируют в ацетоне 15 мин при температуре -1...-2 °C. На препараты наносят флуоресцирующий иммуноглобулин, входящий в состав набора диагностикумов, в рабочем разведении, указанном на этикетке, и помещают их во влажную камеру (чашки Петри с фильтровальной бумагой, увлажненной дистиллированной водой) на 25 мин при температуре 37 °C, затем промывают в трех сменах фосфатно-буферного раствора (ФБР), ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Препараты исследуют под люминесцентным микроскопом (возбуждающие светофильтры СЭС-14-4, ФС-1, БС-8-2, запирающий ЖС-18).

2.3. Для контроля применяют метод подавления ИФ, который заключается в том, что на приготовленные из патологического материала мазки-отпечатки наносят нефлуоресцирующую специфическую сыворотку к вирусу болезни Тешена, а затем флуоресцирующий иммуноглобулин к тому же вирусу. Подготовку препаратов и их исследование проводят, как указано в п. 2.2.

2.4. Положительным результатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне мозговой ткани, которая светится серовато-желтым или зеленоватым цветом. В контрольных препаратах специфическое свечение отсутствует.

3. Выделение и идентификация вируса в культуре клеток.

3.1. Выделение, титрование и типирование вируса в культуре клеток проводят одновременно. Для этой цели используют первично-трипсинизированную культуру клеток почек поросят (ПЭС) или перевиваемую линию клеток СПЭВ. В качестве ростовой среды применяют среду 199 и 0,5%-ный гидролизат лактальбумина или 5%-ный гемогидролизат aa с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (pH среды 7,0...7,2). Поддерживающая среда состоит из тех же сред, но без сыворотки крупного рогатого скота (pH 7,2...7,4). Антибиотики добавляют по 100 ЕД пенициллина и 50 мкг стрептомицина на 1 мл среды. Для приготовления разведений компонентов при постановке реакции применяют солевые буферные растворы с pH 7,2...7,4 (раствор Хенкса, фосфатно-буферный раствор, забуференный физраствор и др.).

3.2. Подготовка материала к исследованию. Пробы головного и спинного мозга, если они фиксированы глицерином, отмывают фосфатным буферным раствором от глицерина, растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на том же буферном растворе. Суспензию дважды замораживают в морозильной камере холодильника с последующим оттаиванием при 37 °C, затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и добавляют к ней хлороформ в соотношении 1:1. Смесь встряхивают в течение 1 ч и оставляют ее на 14...16 ч при температуре 4 °C. Затем суспензию отделяют от хлороформа центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 30 мин, добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина на 1 мл, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, проверяют на отсутствие бактериальной флоры (посев МПА, МПБ, МППБ) и используют для заражения культуры клеток.

3.3. Выделение вируса. Подготовленный материал каждой пробы вносят по 0,1 мл в 4 пробирки с культурой клеток, из которых предварительно удаляют питательную среду, а монослой клеток промывают раствором Хенкса. Зараженную культуру клеток выдерживают при температуре 37 °C в течение 30 мин и затем в каждую пробирку вносят по 0,9 мл поддерживающей среды. Для контроля культуры клеток 4 пробирки оставляют незараженными. Зараженные и контрольные пробирки инкубируют при 37...38 °C.

3.4. Титрование и типирование выделяемого изолята вируса. Для титрования и типирования выделяемого изолята вируса используют подготовленную суспензию пробы мозга.

Типирование проводят в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сыворотки к вирусу болезни Тешена, входящей в состав набора диагностикумов. Иммунная сыворотка используется в рабочем разведении, указанном на этикетке,

Для проведения титрования в первом ряду пробирок делают последовательные 10-кратные разведения суспензии пробы мозга с 10-1 по 10-5. Для типирования во второй ряд пробирок с 0,5 мл каждого разведения суспензии добавляют по 0,5 мл иммунной сыворотки в рабочем разведении и встряхивают. Все пробирки выдерживают в термостате 1,5 ч при 37 °C.

Каждое разведение суспензии, начиная с 10-5, вносят по 0,1 мл в пробирки с культурой клеток (по 4 на каждое разведение), в которых предварительно ростовую среду заменяют на 0,9 мл поддерживающей. Таким же образом все разведения суспензии с сывороткой вносят по 0,2 мл в 4 пробирки с культурой клеток, в которых предварительно ростовая среда была заменена на 0,8 мл поддерживающей. Для контроля оставляют 4 пробирки незараженными. Инокулированные и контрольные пробирки инкубируют в термостате при 37...38 °C.

3.5. Учет результатов. Для учета результатов пробирки просматривают под малым увеличением микроскопа через каждые 24 ч в течение 7...8 сут до появления цитопатических изменений. ЦПД вируса энзоотического энцефаломиелита свиней наступает через 24...168 ч и характеризуется округлением клеток, преломляющих свет, с последующим разрушением всего монослоя. При отсутствии ЦПД вируса в первом пассаже проводят еще два последовательных пассажа с одновременным титрованием и типированием. Если ЦПД в течение 3 пассажей не проявилось, результат считают отрицательным.

При наличии ЦПД проводят учет по титрованию и типированию изолята вируса. Для определения титра вируса одна пробирка с проявлением ЦПД составляет 0,25 lg. Например, ЦПД отмечено во всех пробирках с разведением от 10-1 до 10-4 и в двух пробирках — с разведением 10-5. Титр вируса составит 4,5 lg.

Результат типирования считают положительным, если титр вируса без сыворотки составляет не ниже 3 lg, а во всех пробирках, инокулированных вируссывороточной смесью, ЦПД не отмечено.

4. Идентификация вируса в культуре клеток методом ИФ.

4.1. Культуру клеток ПЭС или СПЭВ выращивают на покровных стеклах в пробирках или пенициллиновых флаконах. Сформировавшийся монослой клеток (после отмывания от сыворотки и замены ростовой среды на поддерживающую) заражают изолятом вируса в объеме 0,2 мл и инкубируют в термостате при температуре 37 °C до появления ЦПД (24...48 ч). Стекла извлекают, промывают 2...3 раза фосфатно-буферным раствором, подсушивают на воздухе и фиксируют в течение 15 мин в ацетоне. Одновременно фиксируют и незараженную культуру клеток. На препараты, помещенные во влажную камеру, наносят флуоресцирующий иммуноглобулин в рабочем разведении, указанном на этикетке. Препараты выдерживают 30 мин при 37 °C, затем обильно промывают ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают. Микроскопию проводят на люминесцентном микроскопе.

4.2. Положительным результатом считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток в виде фокусов из 3...4 пораженных клеток. В контрольных препаратах специфическое свечение отсутствует.

5. Ретроспективная диагностика.

5.1. Ретроспективную диагностику энзоотического энцефаломиелита свиней осуществляют в РН в культуре клеток.

5.2. В РН используют антиген, входящий в состав набора диагностикумов, и парные (или однократно отобранные) сыворотки крови переболевших и находившихся в контакте с ними животных.

Сыворотки предварительно инактивируют при 56 °C в течение 30 мин. Затем готовят двукратные разведения (до 1:512) в объеме 0,5 мл и к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,5 мл антигена с содержанием вируса в 0,1 мл 100 ТЦД50 (дозу вируса определяют исходя из его титра, указанного на этикетке). Вируссывороточную смесь выдерживают один час в термостате при 37 °C, после чего смесь каждого разведения по 0,2 мл вносят в 2...4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростовая среда заменена на 0,8 мл поддерживающей. Одновременно ставят контроли: 4 пробирки с незараженной культурой клеток; по 4 пробирки с культурой клеток, зараженной 100, 10, 1 и 0,1 дозами вируса; 4 пробирки с культурой клеток, инокулированной наименьшим разведением сыворотки (контроль токсичности сыворотки).

Опытные и контрольные пробирки с культурой клеток инкубируют при 37 °C.

5.3. Учет результатов титрования антител проводят на 4-е и 7-е сутки. Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки, которое нейтрализует 100 ТЦД50 вируса в 50% инокулированных вируссывороточной смесью пробирках.

Результат считается положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках в 4 раза и более или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50% и более сывороток крови однократно обследованных животных.

6. Постановка биопробы.

6.1. Биопробу ставят на здоровых поросятах 2...4-месячного возраста из благополучного по инфекционным болезням животных хозяйства. Для заражения и контроля используют по 2 поросенка.

6.2. Подопытных поросят заражают 5%-ной суспензией головного и спинного мозга от убитых больных свиней или вируссодержащей культуральной жидкостью.

Суспензию центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 30 мин, в надосадочную жидкость добавляют пенициллин из расчета 1000 ЕД и стрептомицина 500 мкг на 1 мл, выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч и проверяют на отсутствие бактериальной флоры (посев на МПА, МПБ, МППБ).

Надосадочную жидкость вводят подопытным поросятам по 0,2...0,4 мл интрацеребрально и по 1 мл на скарифицированную слизистую каждой ноздри. При заражении подопытных поросят вируссодержащей жидкостью доза ее и метод заражения те же, что и при заражении суспензией.

Наблюдение за подопытными и контрольными животными ведут в течение 1 мес. Животных содержат в изолированных условиях.

6.3. Биопробу считают положительной при развитии у зараженных животных клинических признаков энзоотического энцефаломиелита свиней и отсутствии таких признаков у контрольных.

7. Сроки исследования.

7.1. Сроки исследования методом иммунофлуоресценции — 1...2 сут, по выделению и идентификации вируса энзоотического энцефаломиелита — 10...30 сут, по выявлению типоспецифических антител в сыворотках крови — 3...14 сут, постановка биопробы — 1 мес. (1).

---