Методические указания по определению биологической активности вирусвакцин против ньюкаслской болезни птиц
(утв. Минсельхозом СССР 12.07.1980 № 115-6)
Утверждены 12 июля 1980 г. № 115-6
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСВАКЦИН ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ
1.1. Определение биологической активности вируса против ньюкаслской болезни проводят в республиканских, краевых, областных, зональных и специализированных ветеринарных лабораториях специалисты, владеющие методами вирусологических исследований.
1.2. Биологическую активность вирусвакцин определяют методом титрования на развивающихся эмбрионах кур с последующей статистической обработкой полученных данных.
Вакцину исследуют на биологическую активность перед ее применением для аэрозольной вакцинации птиц против ньюкаслской болезни, также в случаях выявления нарушений режимов хранения или транспортировки биопрепарата.
2.1 Для проведения титрования необходимо иметь:
- оборудованный бокс с предбоксником для вирусологической работы, темную комнату, овоскоп, термостат, центрифугу и бытовой холодильник;
- стерильные плоскодонные колбы (50...250 мл), пастеровские пипетки, градуированные пипетки (1 и 10 мл), пипетки Мора (25...100 мл), шприц для инъекции (1 мл) с иглами (лучше туберкулиновые), пробойник;
- стерилизатор, штативы, глазные пинцеты, глазные изогнутые остроконечные ножницы, лотки с ячейками для эмбрионов, эмалированные кюветы, фарфоровая (стеклянная) кружка;
- антибиотики (пенициллин и стрептомицин), спиртовой раствор йода (0,1%-ный), раствор лимоннокислого натрия (4...5%-ный), взвесь эритроцитов кур (5%-ная), стерильный физиологический раствор (pH 7,1...7,3), стерильные ватные тампоны, парафин, дезраствор (2%-ный раствор едкого натра или хлорамина);
- 9...11-дневные развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) с белой скорлупой и петухи-доноры.
2.2. Для исследования берут 3 ампулы или 3 флакона каждой исследуемой серии вакцины из разных коробок.
2.3. Для определения биологической активности вируса лентагенных штаммов («В1», «Н», «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ» и др.) используют РЭК 9...10-дневного возраста, а из мезогенных штаммов («Н» и др.) — 10...11-дневного возраста, полученные из благополучного хозяйства.
Для титрования вируса можно использовать РЭК, полученные и от кур, привитых инактивированной или живой вакциной из группы лентагенных штаммов.
2.4. Перед заражением РЭК просматривают на овоскопе, все погибшие, слабые и с неправильным расположением пуги выбраковывают. У остальных простым карандашом отмечают пугу и очерчивают в бессосудистой зоне место для введения вируса.
2.5. На каждое испытуемое 10-кратное разведение вируса используют по 4 эмбриона. При этом на скорлупе каждого эмбриона делают соответствующую маркировку (наименование штамма, номер серии, разведение и дату заражения). Четыре эмбриона оставляют в качестве контроля.
2.6. Маркированные по разведениям (от 10-5 до 10-10) и контрольные РЭК размещают на чистом профламбированном металлическом (деревянном) лотке и до заражения помещают в термостат. При этом в термостате должны быть емкости с водой и открытые вентиляционные каналы.
3. Титрование вируса и статистическая обработка.
3.1. Перед тем как приступить к титрованию, обращают особое внимание на расфасовку вакцины в ампулах (флаконах), подвергнутых лиофильному высушиванию. Количество доз и объемное содержание вируса в ампуле (флаконе) указано в Наставлении по применению сухой вирусвакцины против ньюкаслской болезни.
3.2. Исходное разведение лиофилизированного вируса готовят в колбе, начиная с разведения 10-1 (без учета наполнителя), при этом на каждый миллилитр вируса в ампуле (флаконе) берут по 10 мл физиологического раствора (при работе с нативным вирусом берут его 1,0 мл и добавляют 9,0 мл физиологического раствора), содержащего по 200 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина.
Пример: 3 ампулы сухой вирусвакцины из штамма «Н» с содержанием в каждой по 0,5 мл вируса разводят в 15 мл, а 3 ампулы вакцины из штамма «Ла-Сота» с содержанием в каждой по 2 мл вируса, разводят в 60 мл физиологического раствора и т.п. Полученную взвесь тщательно взбалтывают и оставляют на 10...15 мин до полного растворения.
3.3. Десятикратное растворение вируса готовят следующим образом. В 9 стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильного физиологического раствора. Затем из исходного разведения вируса (10-1), предварительно взболтанного до однородной взвеси, берут 1 мл и переносят в пробирку № 2, не касаясь ее содержимого, получают разведение 10-2. Пипетку, которой внесли исходную взвесь, помещают в кружку с дезинфицирующим раствором. Новой пипеткой путем трехкратного пипетирования перемешивают взвесь в пробирке № 2, отбирают 1 мл содержимого и переносят в пробирку № 3, не касаясь ее содержимого, получают разведение 10-3. Так готовят и последующие разведения вируса до 10-10 включительно, используя при этом на каждое разведение отдельную градуированную пипетку.
3.4. Приготовленными 10-кратными разведениями вируса заражают эмбрионы в аллантоисную полость одним стерильным шприцем, начиная от разведения 10-10 и до 10-5 включительно. Перед заражением ранее отмеченную пугу и бессосудистую зону РЭК обрабатывают спиртом с 0,1%-ным содержанием настойки йода и фламбируют. Затем стерильным пробойником в скорлупе пробивают два отверстия, сначала в центре пуги, а затем в бессосудистой зоне. Каждым разведением вируса заражают по 4 эмбриона в объеме 0,1 мл. После заражения РЭК отверстия заливают расплавленным парафином сначала в месте введения, а затем в области пуги. Зараженные РЭК помещают в термостат и овоскопируют 2 раза в день (утром и вечером). Гибель отдельных РЭК в течение первых 24 ч считается неспецифической.
3.5. Зараженные и контрольные РЭК инкубируют: в течение 72 ч — инфицированные штаммом «Бор-74 ВГНКИ», 96 ч — штаммами «В1» и «Ла-Сота» и 120 — штаммом «Н».
По истечении срока инкубации проводят учет результатов титрования: для штаммов «В1», «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ» по наличию гемагглютинации в исследуемых разведениях, используя при этом феномен «спонтанной» реакции гемагглютинации (кровь живого эмбриона + экстраэмбриональная жидкость этого же эмбриона) и капельной реакции гемагглютинации (экстраэмбриональная жидкость павших РЭК после 24 ч + 5%-ная взвесь эритроцитов кур); для штамма «Н» по наличию гемагглютинации в исследуемых разведениях и капельной реакций гемагглютинации (экстраэмбриональная жидкость только павших РЭК после 24 ч + 5%-ная взвесь эритроцитов кур).
3.6. «Спонтанную» и капельную реакцию гемагглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах или профламбированных кюветах. Вскрытие начинают с контрольных РЭК, а затем от разведения 10-10 и до 10-5, при этом на каждый вскрытый эмбрион используют отдельную пастеровскую пипетку.
3.7. При постановке «спонтанной» капельной реакции гемагглютинации живые РЭК вскрывают со стороны пуги, отделяют ее, надрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки. Кровь, полученную при травмировании сосудов РЭК, смешивают (пипетированием) с экстраэмбриональной жидкостью и 2...3 капли смеси переносят на предметные стекла. Затем через 5...8 мин, осторожно наклоняя и покачивая, наблюдают за проявлением хлопьев агглютинирующих эритроцитов. Положительная реакция гемагглютинации служит показателем наличия вируса. В контрольных (незараженных) РЭК реакция должна быть отрицательной.
3.8. Капельную реакцию гемагглютинации от павших РЭК ставят так же, как и от живых, но здесь, к полученной экстраэмбриональной жидкости от каждого эмбриона добавляют по 1 капле 5%-ной взвеси эритроцитов кур, тщательно перемешивают и ведут учет реакции через 5...8 мин.
3.9. Полученные результаты записывают в следующем виде, изложенном в таблице 33.
Протокол титрования на РЭК вируса ньюкаслской болезни
3.10 Титр вируса определяют по методу Кербера, видоизмененному П.П. Ашмариным, по формуле
lg\text{ЭИД}_{50}0,1\text{мл} = lg\text{Д}_{N} - \sigma \cdot (\sum \alpha_{i} - 0,5) ,
где ЭИД50/0,1 мл — титр вируса в объеме 0,1 мл, способный вызвать инфицирование 50% зараженных РЭК; ДN - максимальная испытуемая доза вируса (10-5); \sigma — логарифм кратности разведения (в нашем примере 10-кратные разведение, \sigma = 1 ); \alpha_{i} — отношение числа РЭК в испытуемых разведениях, давших положительную реакцию гемагглютинации, к общему числу зараженных; \sum \alpha_{i} — сумма значений \alpha_{i} , найденных во всех испытуемых разведениях (в нашем примере \sum \alpha_{i} = 3,50 ).
3.11. Для получения необходимых данных производят следующие расчеты (табл. 34).
| Разведения вируса | Результаты заражения | |
|---|---|---|
| 10-5 | 4/4 | 1,00 |
| 10-6 | 4/4 | 1,00 |
| 10-7 | 3/4 | 0,75 |
| 10-8 | 2/4 | 0,50 |
| 10-9 | 1/4 | 0,25 |
| 10-10 | 0/4 | 0,00 |
Пользуясь этими данными, находим по формуле титр вируса:
lg ЭИД50/0,1 = lg 10-5 — lg 101·(3,50 — 0,5) = = -5 — 1·3,00 = -5 — 3,00 = -8,00.
lg ЭИД50/мл = -9,00 (или 10-9,00 ЭИД50/мл).
Антилогарифм полученного значения: 10-9,00 ЭИД50/мл, он равен разведению 1:1 000 000 000, т.е. 1 мл вируса содержит 1 000 000 000 ЭИД50 (или 10-9,00 ЭИД50/мл).
3.12. Биологическую активность вирусвакцин из штаммов «В1», «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ» выражают в ЭИД50/мл, а из штамма «Н» — в ЭЛД50/мл.
3.13. Для практического использования биологическая активность сухой вирусвакцины из штамма «В1» должна быть не ниже 107,0 ЭИД50/мл, из штаммов «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ» — 107,5 ЭИД50/мл, а из штамма «Н» — не ниже 107,0 ЭЛД50/мл.
3.14. Цифровые значения антилогарифмов биологической активности вирусвакцин определяют при помощи таблицы В.М. Брадиса по цифровым показателям мантиссы и характеристики (табл. 35).
Значения функции десятичных антилогарифмов
Пример. Биологическая активность вакцин 108,00 и 108,25 ЭИД50/мл имеет активность в цифровом выражении 1:100 000 000 и 1:177 800 000 ЭИД50 соответственно, т.е. искомое число антилогарифма 8,25 (8 — характеристика, 25 — мантисса) определяется показателем мантиссы на месте пересечения десятых и сотых цифровых значений (табл. 35), а характеристика указывает на количество знаков в цифровом выражении.
3.15. Результаты титрования записывают в соответствующей книге (журнале) учета по произвольной форме.
В книге указывают наименование биопрепарата и учреждения, его изготовившего, номер серии и дату ее изготовления, дату поступления на исследование и наименование хозяйства, откуда препарат поступил.