--- title: "\"Экспресс-метод определения микробиологических показателей качества питьевой воды, воды поверхностных и подземных источников. Методические указания\"" number: "1100/83-99-23" issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/110083-99-23" --- ## "Экспресс-метод определения микробиологических показателей качества питьевой воды, воды поверхностных и подземных источников. Методические указания" # "Экспресс-метод определения микробиологических показателей качества питьевой воды, воды поверхностных и подземных источников. Методические указания" (утв. Минздравом РФ 18.01.1999 N 1100/83-99-23)
Утверждаю
Руководитель Департамента
госсанэпиднадзора
Минздрава России
**А.А.МОНИСОВ**
18 января 1999 г. N 1100/83-99-23
Дата введения:
с момента утверждения
#### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ **И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ** **ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ, ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ** **И ПОДЗЕМНЫХ ИСТОЧНИКОВ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** Методические указания разработаны творческим коллективом в составе: Военная академия химической защиты Ишутин В.А., Стехин А.А., Яковлева Г.В., Корякин Ю.Н., ВЦМК "Защита" Зубарев А.Ф., НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды имени А.Н. Сысина РАМН Доскина Т.В., Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Михайлова Р.И., Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России Стреляева Н.Е., Кривопалова Н.С., Подунова Л.Г., Скачков В.Б. Утверждены и введены в действие. Введены впервые. ### 1. Область применения Настоящие методические рекомендации являются первым опытом методического обеспечения экспресс-контроля качества питьевой воды и воды источников хозяйственно-питьевого водоснабжения по микробиологическим показателям, введенным: СанПиНом "Требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества" 2.1.4.559; ГОСТом 2761 "Контроль качества воды поверхностных и подземных водоисточников", и предназначены для микробиологов городских, районных, областных, краевых и республиканских центров госсанэпиднадзора и специалистов ведомственных лабораторий, осуществляющих контроль качества воды. Методики регламентируют проведение микробиологического экспресс-контроля загрязнения воды. ### Экспресс-метод определения общего микробного числа хемилюминесцентным методом Настоящие методические рекомендации устанавливают методику хемилюминесцентного количественного определения в 1 куб. см воды централизованного хозяйственного питьевого водоснабжения и в поверхностных водоисточниках клеток мезофильных и мезотрофных бактерий в вегетативной форме. #### 1. Принцип методики Количественное определение клеток бактерий в вегетативной форме в воде основано на их способности инициировать хемилюминесценцию люминола в щелочной среде, интенсивность которой пропорциональна числу клеток, находящихся в анализируемой пробе. #### 2. Чувствительность и сущность метода Бактериальные клетки в вегетативной форме могут быть обнаружены хемилюминесцентным методом в количестве 2 КОЕ/куб. см. Определению не мешают продукты метаболизма бактериальных клеток, их отмершие фрагменты, катионы металлов с переменной валентностью в концентрациях до одного ПДК. Определение проводят на хемилюминометре ЛИК, концентрирование клеток на мембранный фильтр не проводят. #### 3. Средства измерений, материалы и реактивы #### 3.1 Средства измерений Хемилюминометр ЛИК ТУ 000.000.АЖП #### 3.2 Вспомогательные устройства Дозатор пипеточный ТУ 64-1-3329 Пробоотборник для отбора проб воды Пинцет Стерильный флакон с притертой пробкой вместимостью 0,5 куб. дм #### 3.3 Материалы Бумага фильтровальная ГОСТ 12026 Мембранный фильтр "Владисарт" для ОМЧ SM-13806, поры 0,45 мкм БГКП-SM-13906 #### 3.4 Реактивы Натрий серноватистокислый СТ СЭВ 223 Реактив на основе люминола 3%-ный водный раствор перекиси водорода Вода дистиллированная ГОСТ 6709 Спирт этиловый реактификованный ГОСТ 5962 #### 4. Требования по безопасности 4.1. При работе с реактивом и спиртом соблюдаются требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005. 4.2. При работе на приборе ЛИК соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора. #### 5. Требования к квалификации оператора К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию лаборант с опытом работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН МЗ РФ. #### 6. Условия проведения измерений Измерения проводятся при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст., температуре окружающего воздуха (20 +/- 15 °С) в лабораторных или полевых условиях при отсутствии атмосферных осадков. #### 7. Подготовка к выполнению измерений 7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. #### 7.2 Приготовление рабочего реактива. В чистую пробирку пипеточным дозатором наливают 0,2 куб. см 3%-ной водной перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива. Приготовленный рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его приготовления. 7.3. Приготовление исходных разведений чистых культур E.coli или Вас. subtilis (Вас. cereus) для построения градуировочного графика в диапазоне концентраций клеток от 10 до 100 КОЕ/куб. см. С косячка или из чашки Петри с помощью петли (крючка) переносят колонию чистой культуры в стерильную пробирку с соблюдением мер стерильности и добавляют в нее стерильный физраствор объемом 10,0 куб. см. Содержимое тщательно перемешивают до исчезновения видимых сгустков и фильтруют через 3-слойный марлевый стерильный фильтр. После фильтрации исходного разведения с помощью стандартов мутности или камеры Горяева-Тома определяют исходную концентрацию бактериальных клеток. Готовят серию разведений с соблюдением мер стерильности следующим образом. От исходного разведения отбирают 2,0 +/- 0,1 куб. см, помещают в стерильную пробирку и добавляют в нее 2,0 +/- 0,1 куб. см стерильного физраствора. Пробирку закрывают пробкой и содержимое перемешивают встряхиванием в течение 3-х минут. Аналогичным образом готовят все остальные разведения до конечной концентрации, равной 10 +/- 5 КОЕ/куб. см. #### 7.4 Построение градуировочного графика. 7.4.1. Определение фона (сигнала) от стерильного раствора. Передвигают крышку прибора ЛИК до упора вперед, снимают крышку-дозатор, наливают в кювету из стекла 0,3 куб. см рабочего реактива, устанавливают кювету с реактивом в реакционную камеру прибора и закрывают ее крышкой-дозатором. В полость крышки-дозатора наливают 0,1 куб. см стерильного физраствора, крышку прибора передвигают до упора назад и нажимают на нее рукой. С индикатора прибора снимают показания и записывают их в рабочий блокнот. Операцию повторяют 3 раза, вычисляют среднее значение и записывают полученный результат в рабочий журнал. ##### 7.4.2 Анализ разведения бактериальной культуры. Анализ приготовленного разведения бактериальной культуры начинают с разведения, содержащего 10 +/- 5 КОЕ/куб. см, и проводят в той же последовательности, как указано в [п. 7.4.1](#p100052). Внимание!!! Реактив и разведения бактериальной культуры отбирать разными наконечниками дозатора пипеточного во избежание загрязнения реактива. По окончании анализа разведения культуры из вычисленных средних значений показаний прибора вычитают показания фона от физраствора и получают истинные значения хемилюминесцентного анализа. ##### 7.4.3 Построение градуировочного графика. Градуировочный график строят на миллимитровой бумаге в координатах: величина измеренного сигнала - концентрация клеток бактерий в анализируемом разведении. В последующем график уточняют после поверки (ремонта) прибора или по усмотрению (желанию) специалиста-микробиолога. #### 8. Определение общего микробного числа в пробах воды #### 8.1 Отбор проб воды. 8.1.1. Вода из сети централизованного водоснабжения отбирается во флаконы объемом 0,5 куб. дм. Для этого во флаконы вносят по 10 г серноватистокислого натрия и стерилизуют их установленным образом. После стерилизации в них отбирают пробу хлорированной воды объемом 490 +/- 5 куб. см. ##### 8.1.2 Вода из водоисточников децентрализованного водоснабжения. Пробы воды отбирают в стерильные флаконы объемом 0,5 куб. дм батометром с соблюдением мер стерильности. #### 8.2 Определение фона (сигнала) воды. Флакон с пробой воды вскрывают, отбирают стерильной пипеткой 5 куб. см воды, фильтруют ее через 2-слойный бумажный фильтр и определяют фон (сигнал), как указано в [п. 7.4.1](#p100052). 8.3. Определение числа клеток бактерий в анализируемой пробе в вегетативной форме. Содержимое флакона тщательно перемешивают встряхиванием в течение 3-х минут и анализируют на приборе, как указано в [п. 7.4.1](#p100052). Из полученной средней величины сигнала вычитают величину фона воды, полученную по [п. 8.2](#p100068), и по градуировочному графику определяют искомую концентрацию бактерий в воде. #### 8.4 Определение бактерий в воде в споровой форме. ##### 8.4.1 Приготовление жидкой питательной среды. На аналитических весах взвешивают 5 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г глюкозы и растворяют их в 1 куб. дм стерильной дистиллированной воды. 5 Полученную смесь стерилизуют при 112 °С (0,49 х 10 Па) 12 минут. 8.4.2. Отобранную пробу воды тщательно перемешивают в течение 3 минут встряхиванием, отбирают от нее 8 +/- 0,1 куб. см в стерильную чистую пробирку, куда добавляют 2 +/- 0,1 куб. см приготовленной жидкой питательной среды. Содержимое флакона тщательно перемешивают встряхиванием в течение 1 минуты и помещают на 4 часа в термостат при температуре (37 +/- 0,5 °С). 8.4. По истечении 4 часов термостатирования пробы содержимое пробирки перемешивают встряхиванием в течение 1 минуты и анализируют на приборе, как указано в [п. 7.4.1](#p100052). Из полученного среднего значения показания прибора вычитают величину показания (сигнала), полученную по [п. 8.3](#p100070), и по градуировочному графику определяют концентрацию бактерий в споровой форме. 8.5. Общее содержание клеток мезофильных и мезотрофных бактерий в анализируемой пробе будет равно сумме клеток, полученных по [п. 8.3](#p100070) и [п. 8.4](#p100072). ### Экспресс-метод определения колифагов хемилюминесцентным методом Настоящие методические указания устанавливают методику определения колифагов в 100 куб. см воды в системах централизованного и децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. #### 1. Принцип метода Определение колифагов в воде основано на контроле изменения интенсивности хемилюминесценции люминола в щелочной среде, инициируемой лизисными и нелизисными клетками E.coli. #### 2. Чувствительность и сущность метода определения Чувствительность метода составляет 2 КОЕ/куб. см. Сущность метода состоит в сравнении изменения интенсивности хемилюминесценции люминола, инициируемой в щелочной среде клетками E.coli, до и после контаминации их с колифагами в течение определенного времени. Определению не мешают продукты метаболизма, отмершие клетки и питательная среда. #### 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы #### 3.1 Средства измерений Хемилюминометр ЛИК ТУ 000.000.АЖП #### 3.2 Вспомогательные устройства Дозатор пипеточный ТУ 64-1-33-29 Батометр Пробирки микробиологические Термостат электрический с автоматическим терморегулятором до 50 °С Флакон объемом 150 куб. см #### 3.3 Материалы Бумага фильтровальная ГОСТ 12026 #### 3.4 Реактивы Реактив на основе люминола 3% водный раствор перекиси водорода Спирт этиловый ректификованный, мясопептонный бульон ГОСТ 5962 #### 4. Требования по безопасности 4.1. При работе с реактивами и этиловым спиртом соблюдаются правила безопасности по ГОСТ 1.005. 4.2. При выполнении измерений с использованием прибора ЛИК соблюдают правила по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора. #### 5. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию лаборант и опыт работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН МЗ РФ. #### 6. Условия измерения Измерения проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст., температуре окружающей среды (20 +/- 15) °С в лабораторных и полевых условиях. #### 7. Подготовка и выполнение определений 7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. #### 7.2 Приготовление рабочего реактива. В чистую пробирку дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см 3% водной перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива. Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его приготовления. #### 7.3 Подготовка проб к анализу. Отобранную для анализа пробу воды разливают в три стерильных флакона по 100 куб. см в каждой и добавляют в них по 0,5 куб. см 9 суспензии E.coli концентрации 10 (стандарт мутности 10 ед.), 1 куб. см концентрированного мясопептонного бульона. Содержимое перемешивают встряхиванием в течение 1 минуты и закрывают крышками. Параллельно в стерильный флакон наливают 100 куб. см стерильной дистиллированной воды (водопроводная вода не используется!!!), добавляют в нее 0,5 куб. см суспензии E.coli 9 концентрацией 10 КОЕ/куб. см, 0,1 куб. см мясопептонного бульона и содержимое перемешивают встряхиванием в течение 1 минуты. Флакон закрывают крышкой и его содержимое используют для контроля (контрольная проба). #### 8. Определение колифагов в пробе воды Приготовленные контрольную пробу и пробы анализируемой воды поочередно анализируют на приборе. Для этого крышку прибора передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор, в кювету из стекла наливают 0,3 куб. см рабочего реактива и устанавливают его в реакционную камеру. Камеру закрывают крышкой дозатором и в ее полость, сменив наконечник пипеточного дозатора на чистый, наливают 0,1 куб. см смеси контрольной пробы. Передвигают крышку прибора до упора назад, нажимают на нее рукой и снимают показания прибора. Анализ повторяют три раза, вычисляют среднее значение и записывают в блокнот. После анализа контрольную пробу и пробы анализируемой воды термостатируют в течение 2 час. 15 мин. при температуре 37 +/- 1 °С и проводят анализ проб в той же последовательности: сначала контрольную пробу, а затем пробы анализируемой воды, вычисляют средние значения и сравнивают их между собой. Если показания хотя бы одной из анализируемых проб воды больше показаний контрольной пробы, то в анализируемой воде присутствуют колифаги. ### Экспресс-метод определения лактозоположительных кишечных палочек в воде поверхностных водоисточников хемилюминесцентным методом Настоящие методические рекомендации устанавливают методику хемилюминесцентного определения в 1 куб. дм воды поверхностных водоисточников лактозоположительных кишечных палочек. #### 1. Принцип метода Определение лактозоположительных кишечных палочек основано на их способности инициировать хемилюминесценцию люминола в щелочной среде, величина интенсивности которой пропорциональна числу клеток в анализируемой пробе. #### 2. Чувствительность и сущность метода определения Определение лактозоположительных кишечных палочек выполняют на хемилюминометре ЛИК. Нижний предел чувствительности измерения составляет 2 КОЕ/куб. см. Определению не мешают продукты метаболизма, отмершие клетки и питательная среда. Концентрирование кишечных палочек из воды осуществляют на мембранный фильтр с последующим его термостатированием при температуре 45 +/- 1 °С в течение 2 часов в жидкой питательной среде, содержащей пептон, лактозу и натрия хлорид. #### 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы #### 3.1 Приборы Хемилюминометр ЛИК ТУ 000.000.АЖП #### 3.2 Вспомогательные устройства Дозатор пипеточный ТУ 64-1-33-29 Пинцет Батометр Вакуумный насос Термостат электрический с автоматическим терморегулятором до 50 °С Аппарат фильтровальный с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм Фильтры мембранные или фильтрующие мембраны "Владисарт" марки МФА-МА N 4 - 6, диаметром 35 или 47 мм Флакон из стекла объемом 1 куб. дм Флаконы из стекла или мерные стаканы, бюксы диаметром 50 мм и емкостью 30 - 50 куб. см #### 3.3 Материалы Бумага фильтровальная ГОСТ 12026 #### 3.4 Реактивы Реактив на основе люминола 3% водный раствор перекиси водорода Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962 Вода дистиллированная ГОСТ 6709 Натрий хлористый ГОСТ 4233 Лактоза #### 4. Требования по безопасности 4.1. При работе с реактивами и этиловым спиртом соблюдаются правила безопасности по ГОСТ 1.005. 4.2. При выполнении измерений с использованием прибора ЛИК соблюдают правила по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора. #### 5. Требования к квалификации оператора К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию лаборант и опыт работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН МЗ РФ. #### 6. Условия измерения Измерения проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст., температуре окружающей среды (20 +/- 15) °С в лабораторных и полевых условиях. #### 7. Подготовка и выполнение определений 7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. #### 7.2 Приготовление рабочего реактива. В чистую пробирку дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см 3% водной перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива. Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его приготовления. #### 7.3 Отбор пробы воды. Пробу воды из поверхностного водоисточника отбирают батометром и помещают в стерильную емкость объемом 1 куб. дм. #### 7.4 Приготовление жидкой питательной среды. На аналитических весах поочередно взвешивают 5 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы и растворяют их в 1 куб. дм стерильной дистиллированной воды. 5 Полученную смесь стерилизуют при 112 °С (0,49 х 10 Па) 12 минут. #### 7.5 Концентрирование микробных клеток. Концентрирование проводят путем фильтрования пробы через мембранный фильтр. Для этого фильтровальный аппарат стерилизуют фламбинированием, собирают согласно инструкции и фильтруют через него 1 куб. дм отобранной воды. Подготовку мембранных фильтров и фильтрацию проводят согласно инструкции, прилагаемой к ним. #### 8. Проведение анализа 8.1. Определение величины сигнала фона питательной среды. Крышку прибора передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор, в кювету из стекла наливают 0,3 куб. см рабочего реактива и устанавливают его в реакционную камеру. Камеру закрывают крышкой-дозатором и в ее полость, сменив наконечник пипеточного дозатора на чистый, наливают 0,1 куб. см смеси питательной среды. Передвигают крышку прибора до упора назад, нажимают на нее рукой и снимают показания прибора. Анализ повторяют три раза, вычисляют среднее значение и записывают в блокнот. #### 8.2 Термостатирование мембранного фильтра. Извлекают фламбинированным пинцетом из фильтровального аппарата мембранный фильтр, помещают его в стерильный флакон нижней стороной (или в стаканчик, бюкс), куда наливают 2,0 +/- 0,1 куб. см жидкой питательной среды. Флакон (или стаканчик, бюкс) закрывают крышкой и термостатируют при температуре (45 +/- 1) °С в течение 2 часов. 8.3. Определение лактозоположительных кишечных палочек. По окончании термостатирования флакон извлекают из термостата, всю жидкость над фильтром анализируют на приборе, как указано в [п. 8.1](#p100167), из полученного сигнала вычитают сигнал фона и по градуировочному графику (см. [рекомендации](#p100013) по экспресс-определению ОМЧ) определяют концентрацию кишечных палочек. ### Экспресс-метод определения термотолерантных колиформных бактерий хемилюминесцентным методом Настоящие методические рекомендации устанавливают методику хемилюминесцентного определения в 100 куб. см воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения термотолерантных колиформных бактерий. #### 1. Принцип метода Определение клеток термотолерантных колиформных бактерий в воде основано на их способности инициировать хемилюминесценцию люминола в щелочной среде, величина интенсивности которой пропорциональна числу клеток в анализируемой пробе. #### 2. Чувствительность и сущность метода определения Определение клеток термотолерантных колиформных бактерий выполняют на хемилюминометре ЛИК. Концентрирование микробных клеток из воды осуществляют на мембранный фильтр с последующим его термостатированием при температуре (45 +/- 1) °С в течение 2 часов в жидкой питательной среде, содержащей пептон, лактозу и NaCl. Нижний предел чувствительности измерения составляет 2 КОЕ/куб. см. Определению не мешают продукты метаболизма клеток, питательная среда и их отмершие клетки. #### 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы #### 3.1 Приборы Хемилюминометр ЛИК ТУ 000.000.АЖП #### 3.2 Вспомогательные устройства Дозатор пипеточный ТУ 64-1-33-29 Пинцет Пробоотборник для отбора проб воды Мерный стакан объемом 100 куб. см Термостат электрический с автоматическим терморегулированием до 50 °С Аппарат фильтровальный с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм Вакуумный насос (или инжекторное устройство) Разовые чашки Петри диаметром 50 и менее мм Фильтры мембранные или фильтрующие мембраны "Владисарт", марки МФА-МА N 4 - 6, диаметром 35 или 47 мм Флаконы из стекла объемом 100 куб. см Флаконы из стекла или мерные стаканы, бюксы диам. 50 мм и емкостью 30 - 50 куб. см #### 3.3 Материалы Бумага фильтровальная ГОСТ 12026 #### 3.4 Реактивы Реактив на основе люминола 3% водный раствор перекиси водорода Вода дистиллированная ГОСТ 6709 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962 Натрий хлористый ГОСТ 4233 Лактоза #### 4. Требования к безопасности 4.1. При работе с реактивом и спиртом соблюдают меры безопасности по ГОСТ 1.005. 4.2. При работе на приборе ЛИК соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.019 и инструкцией по эксплуатации прибора. #### 5. Требования к квалификации оператора К выполнению измерений допускаются лица имеющие квалификацию лаборант с опытом работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН МЗ РФ. #### 6. Условия измерения Измерение проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст., температуре окружающего воздуха 20 +/- 5 °С в лабораторных условиях. #### 7. Подготовка к выполнению измерений 7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. #### 7.2 Приготовление рабочего реактива. В чистую пробирку дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см 3% перекиси водорода и прибавляют к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива. Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его приготовления. #### 7.3 Отбор проб воды из системы центрального питьевого водоснабжения. Открывают кран и дают воде свободно истекать в течение 10 минут. Затем трижды ополаскивают три емкости для отбора проб истекающей водой и отбирают в каждую из них поочередно по 100 куб. см с интервалом времени 1 минута между каждым отбором. Емкости закрывают пробкой и нумеруют. #### 7.4 Приготовление жидкой питательной среды. Взвешивают на аналитических весах поочередно по 5,0 г пептона, лактозы и NaCl и растворяют их в 1 куб. дм стерильной дистиллированной воды. Смесь стерилизуют при 112 °С 5 (0,49 х 10 Па) 12 минут. 7.5. Концентрирование микробных клеток проводят путем фильтрования проб воды через мембранный фильтр. Для этого стерилизуют фильтровальный аппарат фламбинированием, собирают согласно инструкции и фильтруют через него 300 куб. см отобранной для анализа воды. Подготовку мембранных фильтров к фильтрации проводят согласно инструкции, прилагаемой к ним. #### 8. Проведение анализа 8.1. Определение величины сигнала фона питательной среды. Крышку прибора передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор. В кювету из стекла дозатором пипеточным наливают 0,3 куб. см рабочего реактива, устанавливают ее в реакционную камеру прибора и закрывают крышкой-дозатором. В полость крышки-дозатора, сменив наконечник дозатора пипеточного на чистый, наливают 0,1 куб. см питательной среды. Крышку прибора передвигают до упора назад, нажимают на нее рукой и с индикатора снимают его показания. Анализ питательной среды повторяют три раза, вычисляют среднее значение и записывают его в блокнот. #### 8.2 Термостатирование мембранного фильтра. Извлекают фламбинированным пинцетом из фильтровального аппарата мембранный фильтр, помещают его нижней стороной в стерильный флакон (разовую чашку Петри, стаканчик или бюкс), куда заливают 2,0 +/- 0,1 куб. см жидкой питательной среды. Флакон закрывают крышкой и термостатируют при температуре (45 +/- 1) °С в течение 2 часов. #### 8.3 Определение термотолерантных колиформных бактерий. По истечении времени термостатирования флакон (или стаканчик, или бюкс) извлекают из термостата и всю жидкую фазу анализируют на приборе ЛИК, как указано в [п. 8.1](#p100220). Вычисляют среднее значение сигнала. Если оно больше среднего значения сигнала фона питательной среды, то проба анализируемой воды содержит клетки термотолерантных колиформных бактерий. ### Экспресс-метод определения общих колиформных бактерий в воде хемилюминесцентным методом Настоящие методические рекомендации устанавливают методику определения в 100 куб. см воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения и в 1 куб. дм воды из подземного водоисточника клеток общих колиформных бактерий. #### 1. Принцип метода Определение клеток общих колиформных бактерий в воде основано на их способности инициировать хемилюминесценцию люминола в щелочной среде, величина интенсивности которой пропорциональна числу клеток в анализируемой пробе. #### 2. Чувствительность и сущность метода определения Определение клеток общих колиформных бактерий выполняют на хемилюминометре ЛИК. Концентрирование микробных клеток из воды осуществляют на мембранный фильтр с последующим его термостатированием при температуре (37 +/- 1) °С в течение 2 часов в жидкой питательной среде, содержащей пептон, глюкозу и NaCl. Нижний предел измерения концентрации бактериальных клеток составляет 2 КОЕ/куб. см. Определению не мешают продукты метаболизма бактерий, их отмершие клетки и питательная среда. #### 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы #### 3.1 Приборы Хемилюминометр ЛИК ТУ 000.000.АЖП #### 3.2 Вспомогательные устройства Дозатор пипеточный ТУ 64-1-33-29 Пинцет Пробоотборник для отбора проб воды Мерный стакан объемом 100 куб. см Разовые чашки Петри диаметром 50 и менее мм Термостат электрический с автоматическим терморегулированием до 50 °С Аппарат фильтровальный с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм Вакуумный насос (или инжекторное устройство) Фильтры мембранные или фильтрующие мембраны "Владисарт", марки МФА-МА N 4 - 6, диаметром 35 или 47 мм Емкость (бутыль) объемом 1 куб. дм Флаконы из стекла или мерные стаканы, бюксы диам. 50 мм и емкостью 30 - 50 куб. см Флаконы из стекла объемом 150 куб. см #### 3.3 Материалы Бумага фильтровальная ГОСТ 12026 #### 3.4 Реактивы Реактив на основе люминола 3% водный раствор перекиси водорода Вода дистиллированная ГОСТ 6709 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962 NaCL ГОСТ 4233-77 Глюкоза, х.ч. ГОСТ 6038-79 #### 4. Требования по безопасности 4.1. При работе с реактивом и спиртом соблюдаются меры безопасности по ГОСТ 1.005-88. 4.2. При работе на приборе ЛИК соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора. #### 5. Требования к квалификации оператора К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию лаборант с опытом работы на приборе ЛИК и прошедшие обучение в ФЦ ГСЭН МЗ РФ. #### 6. Условия измерения Измерение проводят при атмосферном давлении 730 - 760 мм рт. ст., температуре окружающего воздуха (20 +/- 15) °С в лабораторных или полевых условиях. #### 7. Подготовка к выполнению измерений 7.1. Прибор ЛИК готовят к работе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. #### 7.2 Приготовление рабочего реактива. В чистую пробирку наливают 0,3 куб. см 3% водного раствора перекиси водорода и приливают к ней 6,0 +/- 0,1 куб. см реактива. Рабочий реактив годен для анализа в течение 24 часов с момента его приготовления. #### 7.3 Отбор проб воды. 7.3.1. Отбор проб воды из системы централизованного питьевого водоснабжения. Открывают кран и дают воде свободно истекать в течение 10 минут. Затем берут поочередно три флакона, трижды ополаскивают каждый истекающей водой и отбирают по 100 +/- 1,0 куб. см пробы воды с интервалом времени между отбором проб 1 минута. Флаконы закрывают крышкой и нумеруют. 7.3.2. Отбор проб воды из подземного водоисточника. Открывают кран и дают воде свободно истекать в течение 10 минут. Затем берут емкость объемом 1 куб. дм, трижды ополаскивают ее истекающей водой и отбирают пробу объемом 1,0 +/- 0,01 куб. дм. #### 7.4 Приготовление жидкой питательной среды. Взвешивают на аналитических весах 5 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г глюкозы и растворяют их в 1 куб. дм стерильной дистиллированной 5 воды. Указанный раствор стерилизуют при 112 °С (0,49 х 10 Па) 12 минут. #### 7.5 Концентрирование микробных клеток. Стерилизуют фламбированием фильтровальный аппарат и фильтруют через него отобранные для анализа пробы воды. При этом подготовку мембранных фильтров к фильтрации проводят согласно прилагаемой к ним инструкции, а концентрирование микробных клеток из проб осуществляют путем фильтрации проб воды. Для фильтрации проб воды из системы централизованного водоснабжения и подземного водоисточника используют раздельные фильтры. Все три пробы воды централизованного водоснабжения фильтруют через один фильтр. #### 8. Проведение анализа 8.1. Определение величины фона питательной среды. Крышку прибора передвигают до упора вперед, снимают крышку-дозатор, в кювету из стекла наливают 0,3 куб. см рабочего реактива и устанавливают ее в реакционную камеру. Крышкой-дозатором закрывают реакционную камеру и в ее полость наливают 0,1 куб. см жидкой питательной среды пипеточным дозатором с чистой насадкой. Крышку прибора передвигают до упора назад, нажимают на нее рукой и снимают показания прибора. Анализ повторяют три раза, вычисляют среднее значение сигнала и записывают его в блокнот. #### 8.2 Термостатирование мембранного фильтра. Извлекают фламбированным пинцетом из фильтровального аппарата мембранный фильтр, помещают его нижней стороной в стерильный флакон (стаканчик, бюкс, чашка Петри) и заливают в него 2,0 +/- 0,1 куб. см жидкой питательной среды. Флакон (стаканчик, бюкс) закрывают крышкой и термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 2-х часов. #### 8.3 Определение общих колиформных бактерий. По истечении времени термостатирования флакона с мембранным фильтром, на котором сконцентрированы клетки бактерий из проб воды централизованного водоснабжения его извлекают из термостата и всю жидкую фазу над ним анализируют на приборе, как указано в [п. 8.1](#p100276). Вычисляют среднее значение сигнала и сравнивают его с фоном питательной среды. Если он больше, то в анализируемой воде присутствуют искомые бактерии. #### 8.4 Определение числа бактерий группы кишечных палочек. По истечении времени термостатирования извлекают флакон с фильтром, на котором сконцентрированы клетки из воды подземного водоисточника и на приборе анализируют всю жидкую фазу над ним, как указано в [п. 8.1](#p100276). Вычисляют среднее значение сигнала, вычитают из него значение фона питательной среды и по градуировочному графику (см. [рекомендации](#p100013) по экспресс-определению ОМЧ) определяют концентрацию клеток. ### Экспресс-метод определения коли-индекса воды подземных источников #### 1. Введение Настоящая методика разработана для экспрессного определения коли-индекса в воде хемилюминесцентным методом. #### 2. Принцип и характеристика метода Метод основан на использовании способности микробных клеток вегетативной форме инициировать хемилюминесценцию в момент смешения реактива и анализируемой пробы воды, содержащей в себе эти клетки. Диапазон измеряемых концентраций микробных клеток в 9 воде составляет от 10 до 10 КОЕ/куб. см. Суммарная погрешность метода не превышает 20°. Анализ одной пробы выполняют в течение 5 минут. Предел чувствительности - 2 КОЕ/куб. см. #### 3. Аппаратура, посуда, материалы Анализатор ЛИК ТУ 000.000.АЖП Пробирки химические на 10/160 ГОСТ 199198 Дозатор пипеточный П1 ТУ 64-3329 Стеклянная палочка, диаметр 6 мм, длина 200 мм Цилиндр мерный на 50 мл. ГОСТ 1770 Воронка диаметром 36 мм, высота 88 мм ГОСТ 25336 Марлевые фильтры 50 х 50 мм, трехслойные Фильтровальная бумага ГОСТ 12026 Пинцет ГОСТ 9048 Аппарат для мембранной фильтрации Бюкс диаметром 50 мм ГОСТ 1770 #### 4. Реактивы и растворы Реактив ГО-33.10.000.01 Дистиллированная вода ТУ 6-09-2502 Этиловый спирт ГОСТ 18300 Универсальная индикаторная бумага ТУ 6-09-1181 Перекись водорода, ч.д.а. ГОСТ 177 #### 5. Приготовление рабочего реактива 5.1. Определяют исходный объем рабочего реактива исходя из его расхода на один анализ 0,3 мл. Для этого число анализов умножают на 0,3 мл и получают исходный объем реактива. Пример. Необходимо провести 100 анализов 100 х 0,3 мл = 30 мл. 5.2. В чистую пробирку (мерный стакан) наливают 30 мл реактива и прибавляют к нему 1 мл 3% перекиси водорода. (На 6 мл реактива приходится 0,2 мл 3% перекиси водорода.) Приготовленный рабочий реактив пригоден для анализа в течение 24 часов. #### 6. Определение коли-индекса #### 6.1 Спиртом фламбируют аппарат для фильтрации и пинцет. 6.2. В аппарат для фильтрации помещают мембранный фильтр и готовят его к работе согласно инструкции. 6.3. Отобранную для анализа пробу воды тщательно перемешивают встряхиванием в течение 3-х минут и фильтруют ее через мембранный фильтр. 6.4. Извлекают мембранный фильтр из фильтровального аппарата и пинцетом помещают его нижней стороной в стерильный бюкс, куда предварительно наливают 2 мл стерильного физраствора. 6.5. Готовят к работе прибор ЛИК согласно инструкции и определяют на нем фон физраствора. Для этого крышку прибора передвигают до упора вперед, наливают в кювету из стекла дозатором пипеточным 0,3 мл рабочего реактива, помещают кювету в камеру прибора и закрывают ее крышкой-дозатором. Сменив на дозаторе пипеточном наконечник на чистый, наливают в полость крышки-дозатора 0,1 мл стерильного физраствора, крышку прибора передвигают до упора назад, сильно нажимают на нее рукой и снимают показания прибора. Определение повторяют три раза, вычисляют среднее значение фона и записывают его в журнал (блокнот). 6.6. Круговыми движениями экстрагируют мембранный фильтр, помещенный в стерильный бюкс по [п. 6.4](#p100313) в течение 2-х минут и весь жидкий экстракт (физраствор) анализируют на приборе ЛИК, как указано в [п. 6.5](#p100314). Вычисляют среднее значение показаний прибора, вычитают из него значение фона физраствора и по градуировочному графику определяют коли-индекс. #### 7. Техника безопасности Все работы по определению бактерий в воде проводят в строгом соответствии с действующими Правилами и Инструкциями по охране труда. Не допускать попадания реактива и анализируемой пробы на открытые участки кожи и в глаза; в случае попадания немедленно протереть 10% раствором питьевой соды или обмыть обильным количеством воды. При работе с прибором строго выполнять требования по технике безопасности, указанные в инструкции по эксплуатации. ---