Методические указания по выявлению парамиксовирусов, их идентификации и выявлению специфических антител

(утв. Минсельхозпродом РСФСР 06.02.1991 № 044-3)

Утверждены 6 февраля 1991 г. № 044-3

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ПАРАМИКСОВИРУСОВ, ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ВЫЯВЛЕНИЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

1.1 Лабораторные исследования на парамиксовирусную инфекцию птиц основаны на:

- выделении вируса на эмбрионах кур (ЭК) и его идентификации в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

• исследовании проб сывороток крови птиц.

Для проведения исследований на парамиксовирусную инфекцию птиц используют набор, который содержит антигены и сыворотки различных серологических вариантов парамиксовирусов.

2. Подготовка материала к исследованию.

2.1 В лабораторию для исследования доставляют:

• патологический материал от 3...5 больных птиц в первые два дня заболевания (головной мозг, селезенку и легкие);
• сыворотку крови больных и переболевших птиц в количестве 1...2 мл — не менее 20 проб из каждого помещения.

Патологический материал помещают в термос со льдом или в раствор 50%-ного х/ч глицерина, приготовленного на физиологическом растворе (pH 7,2...7,3), и направляют в лабораторию.

2.2. В лаборатории из патологического материала готовят 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе (pH 7,2...7,3), центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные пробирки, добавляют 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мг/мл стрептомицина, выдерживают при комнатной температуре (20 °C) 60 мин, проверяют на отсутствие бактериального загрязнения путем высева на питательные среды МПБ, МПА и используют для заражения эмбрионов кур.

3. Выделение вируса на эмбрионах кур.

3.1. С этой целью исследуемый материал (10%-ную надосадочную суспензию) вводят в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость 3...10-дневным эмбрионам. Заражают не менее 10 эмбрионов, контролем служат 5 незараженных эмбрионов.

3.2. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37...38 °C и относительной влажности 60...70% в течение 96 ч. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибших исследуют в капельной реакции гемагглютинации РГА (п. 4).

Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4 °C.

3.3. Перед вскрытием эмбрионов скорлупу над воздушным пространством (пугой) обрабатывают спиртом, обжигают и из каждого эмбриона отбирают экстраэмбриональную жидкость в стерильные пробирки, одновременно делают высевы на питательные среды МПБ, МПА для контроля на отсутствие бактериальной контаминации.

4. Постановка капельной реакции гемагглютинации (РГА).

4.1. Для постановки капельной реакции гемагглютинации экстраэмбриональную жидкость от каждого эмбриона смешивают в равных каплях с 1%-ной взвесью эритроцитов петуха на стекле или пластинах. При положительной реакции через 2...5 мин появляются хлопья агглютинированных эритроцитов.

4.2. Для получения 1%-ной суспензии эритроцитов используют петухов старше 6 мес. Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2...3%-ным раствором лимоннокислого натрия на физиологическом растворе (pH 7,2...7,3), трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 1%-ную суспензию и хранят ее не более трех суток в условиях холодильника (4 °C).

4.3. При наличии гемагглютинации и отсутствии бактериального загрязнения проводят титрование выделенного вируса в количественной РГА.

В случае отрицательной РГА образцы экстраэмбриональной жидкости объединяют (по 5 ЭК) и проводят еще два пассажа с последующим контролем на вирус в капельной РГА.

5. Постановка количественной РГА.

5.1. Для постановки количественной РГА готовят двукратные разведения исследуемой экстраэмбриональной жидкости ЭК от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок пластин наливают физиологический раствор (pH 7,2...7,3) в объеме по 0,2 мл. В первую лунку вносят 0,2 мл исследуемой жидкости, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 мл смеси во вторую лунку и так далее до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 мл удаляют в дезраствор.

5.2. В каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов, затем пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Контролем служат две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах (по 0,2 мл).

5.3. При положительной РГА эритроциты образуют осадок в виде зонтика. Титром вируса считается то наибольшее его разведение, при котором наблюдается еще агглютинация эритроцитов, что и соответствует 1 АЕ. Выделенный вирус идентифицируют в РТГА.

6. Идентификация вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

6.1. Идентификацию выделенного вируса проводят в РТГА с эталонными специфическими сыворотками.

Подготовку препаратов к работе проводят согласно требованиям, указанным во вкладыше в набор.

6.2. Для постановки РТГА готовят рабочую дозу исследуемого вируса (8 АЕ) исходя из его титра (1 АЕ).

Для этого исходный вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления его титра (1 АЕ) на 8.

Пример: если титр вируса 1:256, то его рабочее разведение будет равняться 256 : 8 = 32, т.е. в 0,2 мл разведенного 1:32 вируса будет содержаться 8 АЕ. В данном примере необходимо взять 31 мл физиологического раствора и 1 мл исходного вируса.

6.3. Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 8 АЕ. Для этого на пластине в 5 лунок наливают по 0,2 мл физиологического раствора, затем в первую лунку добавляют 0,2 мл 8 АЕ вируса и после пипетирования 0,2 мл переносят во вторую лунку, затем в третью, в четвертую и в пятую, а из пятой лунки удаляют 0,2 мл в дезраствор. Таким образом в первой лунке будет 4 АЕ, во второй — 2 АЕ, в третьей — 1 АЕ, в четвертой — 0,5 АЕ, в пятой — 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Пластину встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

6.4. При правильном определении рабочей дозы (8 АЕ) в первой, второй и третьей лунках должна быть полная агглютинация, в четвертой — частичная, в пятой — четко выраженная пуговка. Если в четвертой лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит более 8 АЕ. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации в третьей и в четвертой лунках свидетельствует о недостаточном количестве вируса. Увеличение или уменьшение рабочей дозы проводят добавлением вируса или физиологического раствора и затем повторно проверяют 8 АЕ.

6.5 Постановка РТГА (основной опыт).

В ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 мл физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 мл специфической сыворотки, содержимое второй лунки пипетируют и переносят 0,2 мл смеси в третью лунку и так далее до предельного разведения, указанного на этикетке ампулы. После этого во все лунки вносят по 0,2 мл рабочего разведения вируса (8 АЕ). Пластины встряхивают и после 30-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов.

6.6 Контроли:

• сыворотки (0,2 мл сыворотки + 0,2 мл физиологического раствора и 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов);
• стандартных диагностикумов (0,2 мл 8 АЕ антигена + 0,2 мл гомологичной ему сыворотки + 0,4 мл 1%-ной суспензий эритроцитов);
• эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0,2 мл физиологического раствора + 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов).

Учет реакции проводят через 30...60 мин после полного оседания эритроцитов.

6.7. Идентификацию вируса считают завершенной, если специфическая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность выделенного вируса не менее 1/4... 1/8 ее титра, указанного на этикетке ампулы.

6.8. Для постановки РГА и РТГА микрометодом используют микротитратор системы ТАКАЧИ или микропипетки. Микрореакцию ставят в объеме 0,025 мл (1 капля) вместо 0,2 мл с 0,7%-ной суспензией эритроцитов.

7. Выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц РТГА.

7.1. Наряду с выделением вируса от больной птицы на четвертый день после начала заболевания исследуют сыворотку крови на наличие специфических антител к парамиксовирусу в том случае, если птица не была вакцинирована. С этой целью необходимо исследовать в РТГА не менее 20 проб сыворотки крови с эталонными диагностическими антигенами парамиксовирусов.

7.2. Пробы крови от больных птиц берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные стерильным физиологическим раствором. Полученную кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре, осторожно обводят спицей (или пастеровской пипеткой) и оставляют на 2...3 ч. Затем сыворотку отсасывают в стерильные пробирки и разводят 1:5 дистиллированной водой. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку крови прогревают на водяной бане при 56 °C в течение 30 мин.

7.3. Ампулы (флаконы) с антигенами разводят физиологическим раствором (pH 7,2...7,3) согласно требованиям вкладыша по применению диагностикума.

7.4. Для постановки РТГА готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе, начиная с разведения 1:5 до 1:320. Далее РТГА ставят, как описано в п. 6.

7.5. При обнаружении в сыворотках крови титров 1:10 и выше РТГА ставят повторно. Для этого сыворотки освобождают от неспецифических термостабильных ингибиторов с целью подтверждения наличия в них специфических антител к парамиксовирусу. Для удаления термостабильных ингибиторов через разведенную и прогретую сыворотку крови пропускают углекислый газ из аппарата Киппа или добавляют кусочки сухого льда. Обработку сыворотки ведут в течение 2...3 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость исследуют в РТГА.

7.6. Для одновременного удаления термолабильных и термостабильных ингибиторов сыворотки крови ее обрабатывают нейраминидазой нехолерных вибрионов согласно «Инструкции по применению нейраминидазы нехолерных вибрионов», утвержденной Минздравом РСФСР 19.11.86 г.

7.7. Титром антител в сыворотке считают последнее ее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации с исследуемым антигеном.

8. При выделении титра антител 1:10 и выше в 30...50% исследуемых сыворотках проводят вирусологические исследования.

9. Срок исследований.

Выделение вируса и обнаружение специфических антител — 4...12 дней.

Приложение

К парамиксовирусной инфекции восприимчивы все виды домашних, синантропных и диких птиц. Основным источником возбудителя являются больные птицы с клинически выраженными симптомами болезни или скрытые вирусоносители без проявлений заболевания.

Симптомы заболевания самые разнообразные и зависят от патогенных свойств вируса и других факторов. Они могут быть от самых легких и непродолжительных поражений респираторных органов и желудочно-кишечного тракта до тяжелых проявлений заболевания и 100% гибели птицы: отказ от корма, угнетение, затрудненное дыхание, воспаление воздухоносных мешков, синуситы, конъюнктивиты, диарея, нарушение координации движений, парезы, параличи. Любой из этих признаков может встречаться отдельно или в сочетании с другими. У клинически здоровых или больных может снижаться яйценоскость до 50...60%. Течение болезни может усугубляться другими заразными болезнями, нарушениями в кормлении и содержании птицы.

Вирусоносительство продолжается в течение месяца. По эпизоотологическим, клиническим и патологоанатомическим данным парамиксовирусная инфекция сходна с другими инфекционными заболеваниями птиц.

---