МР № 02.013-06. Определение бактерий рода Salmonella методом твердофазного иммуноферментного анализа. Методические рекомендации

(утв. Роспотребнадзором 08.12.2006)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработаны: ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора при участии ООО «Стай-лаб».

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (от 29 сентября 2006 г.).

3. Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора А.И. Верещагиным 08.12.2006.

4. Введены впервые.

1. Область применения

Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях иных организаций, аккредитованных на право проведения испытаний, исследований.

Методические рекомендации могут быть использованы для целей определения бактерий рода Salmonella при скрининговых исследованиях пищевых продуктов и смывов.

2. Общие положения

Сальмонеллы принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, их биологические характеристики во многом сходны с прочими энтеробактериями. Энтеробактерии обнаруживаются в почве, воде, на поверхности фруктов, овощей, в злаках и других объектах окружающей среды. Многие из этих микроорганизмов имеют эпидемиологическое значение в связи с их патогенностью для человека.

Определение сальмонелл традиционными методами бактериологии в пищевых продуктах занимает длительное время и сопряжено со значительными трудозатратами. Требуется несколько дней для культивирования, селективного выделения и идентификации сальмонелл с последующим подтверждением результатов серологическими и биохимическими методами.

При использовании иммунохимических технологий анализа, таких как твердофазный иммуноферментный анализ, процедуры определения сальмонелл могут быть существенно оптимизированы, а время исследования сокращено. Это актуально при поведении микробиологическими лабораториями производственного контроля пищевых продуктов, сырья и пр. при значительном объеме исследований.

3. Принцип метода твердофазного ИФА

Принципом иммунохимического определения бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах, смывах является твердофазный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах, покрытых моноклональными антителами к термостабильному антигену бактерий. Результатом проведения ИФА служит образование комплекса антиген-антитело при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Использование твердой фазы позволяет надежно разделять компоненты реакции за счет иммобилизации одного из компонентов, не участвующих в реакции.

Для осуществления реакции данного типа используется тест-система LOCATE(R) Salmonella с высокоспецифичными моноклональными антителами к термостабильным «О»-антигенам и соматическим антигенам клеточной стенки бактерий рода Salmonella. Этим обеспечивается эффективное определение как подвижных, так и неподвижных штаммов бактерий. Тест-система LOCATE(R) Salmonella спроектирована в формате стрипованного 96-луночного ИФА-планшета, что позволяет выполнять исследования от 1 до 94 образцов одновременно как при визуальной, так и при автоматической оценке результата (с помощью ридера).

4. Аппаратура, материалы, питательные среды и тест-системы

Термостат электрический с диапазоном измерения от 15 до 65 °С с допустимой погрешностью регулирования температуры +/- 1 °С	ТУ 64-1-1382-83
Стерилизатор паровой медицинский	ГОСТ 19569
Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима в диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью +/- 2 °С
Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа Masticator (или Stomacher) со стерильными полиэтиленовыми пакетами
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150	ТУ 16-535-84
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допустимой погрешностью +/- 2 мг	ГОСТ 24104
Холодильник бытовой электрический	ГОСТ 16317
Пипетки градуированные исполнения 1, 2 классов точности вместимостью 1 куб. см, 10 куб. см	ГОСТ 29227
Пробирки бактериологические вместимостью не менее 10 куб. см	ГОСТ 25336
Посуда широкогорлая	ГОСТ 25336
Питательные среды: Забуференный бульон для обогащения сальмонелл Тетратионатный бульон Селенитовый бульон Висмут-сульфит агар XLD-агар
Компоненты набора тест-системы LOCATE(R) Salmonella:
Микротитровальный стрипованный планшет на 96 лунок, покрытых моноклональными антителами на сальмонеллы	1 шт.
Конъюгат, в рабочем разведении	1 шт.
Положительный контроль (термически дезактивированные бактерии рода Salmonella), 2 мл	1 шт.
Отрицательный контроль (термически дезактивированные бактерии), 2 мл	1 шт.
Концентрирующий моющий буфер, 25-кратный, 20 мл	2 шт.
Субстрат, ТМБ, 15 мл	1 шт.
Стоп-реагент, содержит 2% раствор серной кислоты, 15 мл	1 шт.
Схема планировки планшета	1 шт.

5. Отбор и подготовка проб к анализу

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.

5.2. Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и превышать аналитический образец не менее чем в два раза.

5.3. От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары так, чтобы количество было достаточным для проведения анализа.

5.4. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или без упаковки пробы отбирают из разных точек: с поверхности и с различной глубины.

5.5. Пробы для микробиологических анализов отбирают стерильным инструментом в стерильную посуду до взятия проб на физико-химические и органолептические исследования.

5.6. Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0 — (-1) °С (не менее 1 ч в термостате при температуре 37 °С); продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое), нагревают до температуры 40 — 45 °С и перемешивают.

5.7. Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669-85; из измельченной суспензии составляют навеску необходимой массы (25 г).

5.8. При посевах высококислотных или щелочных (с рН < 6 или > 7,5) жидких и твердых продуктов для предотвращения изменения рН питательных сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0 +/- 0,2 по ГОСТ 30519-97 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella».

5.9. Смывы отбирают с помощью стерильных увлажненных тампонов, сделанных из марли или ваты, с поверхности оборудования и инвентаря площадью 100 куб. см, используя трафарет. Трафарет фламбируют перед каждым употреблением.

6. Определение бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах методом твердофазного иммуноферментного анализа

6.1. Предобогащение: внести 25 г подготовленной пробы в 225 мл бульона предобогащения. Перемешать образец в стомахере, блендере или с помощью другой техники, обеспечивающей достаточно хорошее перемешивание. Инкубировать в течение 18 — 24 ч при 37 °С.

6.2. Селективное обогащение: после инкубации перенести по 0,1 мл предобогащенной пробы в 10 мл тетратионатного бульона и в 10 мл бульона Раппапорта-Вассилиадиса. Инкубировать бульоны в течение 18 — 24 ч при 42 +/- 0,5 °С.

Примечание 1:

Взамен одного из селективных бульонов на второй день допускается использовать селенитовый бульон с режимом инкубации 37 +/- 0,5 °С 24 часа.

6.3. После инкубации перенести по 1 мл культуральной жидкости из каждого бульона селективного обогащения в две пробирки с 10 мл модифицированного GN-бульона <*>, каждую пробирку с GN-бульоном подписать. Инкубировать в течение 4 — 6 ч при 42 +/- 0,5 °С.

---

<*> Модифицированный GN-бульон содержит 10 мкг/мл новобиоцина.

6.4. После инкубации перенести по 1 мл из каждой пробирки с GN-бульоном в одну стеклянную пробирку на 10 мл и проавтоклавировать при 121 °С (допускается использовать кипящую водяную баню в течение 20 мин. для инактивации живых бактерий). Оставшиеся бульоны (не термообработанные) поместить в холодильник до конца исследования.

6.5. Охладить пробу до комнатной температуры. Тщательно перемешать бульон после охлаждения и использовать для ИФА.

7. Подготовка реагентов для ИФА

7.1. Для анализа используется иммуноферментная тест-система LOCATE(R) Salmonella производства R-Biopharm Rhone Ltd.

7.2 Приготовление рабочих разведений растворов, входящих в комплект тест-системы:

7.2.1. Подготовить моющий буфер в рабочем разведении: разбавить концентрат моющего буфера в 25 раз дистиллированной водой (смешать 20 мл буфера и 480 мл дистиллированной воды). Отметить дату приготовления на флаконе с буфером. Хранить буфер в холодильнике.

7.2.2. Рабочий раствор конъюгата: добавить 7 мл буфера для разбавления конъюгата во флакон с сублимированным конъюгатом. Отметить дату приготовления на крышке флакона (срок хранения 28 дней с момента приготовления).

7.2.3 Субстрат (ТМБ) поставляется в рабочем разведении.

7.2.4 Стоп-реагент поставляется в рабочем разведении.

7.2.5. Положительные и отрицательные контроли поставляются в рабочем разведении.

8. Проведение ИФА

8.1. Извлечь из пакета необходимое количество стрипов, разделить на необходимое количество лунок (по одной лунке на каждую пробу) и 2 лунки для контрольных растворов. Поместить лунки в планшетную рамку и зафиксировать. Немедленно упаковать оставшиеся лунки в пакет вместе с силикагелем.

8.2. Внести по 100 мкл растворов положительного и отрицательного контроля в соответствующие лунки. Внести по 100 мкл исследуемых термообработанных бульонов в соответствующие лунки. Обозначить положение каждой лунки на прилагаемой диаграмме. Инкубировать планшет при температуре 37 °С в темноте 30 мин.

8.3. После инкубации с помощью автоматического вошера или многоканальной автоматической пипетки с переменным объемом внести в каждую лунку по 250 мкл моющего буфера. Повторить процедуру промывания еще 3 раза, после чего промыть лунки 1 раз дистиллированной водой. Перевернуть рамку и тщательно выбить капли дистиллированной воды путем постукивания рамки по столу, накрытой фильтровальной бумагой.

8.4. Внести по 100 мкл конъюгата в каждую лунку (при необходимости использования большого количества лунок использовать 8-канальную автоматическую пипетку). Инкубировать планшет при температуре 37 °С 30 мин.

8.5. По окончании инкубации промыть лунки планшета, как описано в п. 8.3.

8.6. Внести по 100 мкл субстрата в каждую лунку (при необходимости исследования большого количества образцов использовать ванночку для реагентов и 8-канальную пипетку). Чтобы снять излишки субстрата с верхнего края лунок, необходимо промокнуть лунки фильтровальной бумагой. Немедленно поставить планшет в темноту, инкубировать его при температуре 37 °С 30 мин.

8.7 Учет результатов:

• При визуальной интерпретации результатов: считывание результатов проводится сразу после инкубации. Стоп-реагент не добавляется.
• При автоматизированном учете результатов: по окончании инкубации добавить в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента. В течение 5-ти минут (не более) после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке, используя фотометр планшетный (ридер) с длиной волны 450 нм.

9. Интерпретация результатов

9.1 Интерпретация результатов, полученных с помощью ридера:

9.1.1. При значении оптической плотности 0,3 и менее результат расценивается как отрицательный — в исследованной пробе пищевого продукта бактерии рода Salmonella не обнаружены.

9.1.2. При значении оптической плотности более 0,3 проба пищевого продукта расценивается как положительная, и требуется подтверждение наличия в исследуемом образце жизнеспособных бактерий рода Salmonella традиционными методами, описанными в разделе 10.

9.2 Интерпретация результатов при визуальном учете:

9.2.1. При окраске содержимого лунки в синий цвет результат расценивается как положительный, и требуется подтверждение наличия жизнеспособных бактерий рода Salmonella.

9.2.2. При окраске содержимого лунки в прозрачный или бледно-голубой цвет результат расценивается как отрицательный, то есть проба пищевого продукта не содержит жизнеспособных бактерий рода Salmonella.

10. Подтверждение положительных результатов

10.1. Из модифицированного GN-бульона, не подвергавшегося термообработке, отобрать 1 мл и перенести в 10 мл свежего модифицированного GN-бульона. Одновременно провести высев на плотные питательные среды (не менее 2). Инкубировать чашки 24 ч при температуре 37 °С. При наличии подозрительных колоний провести биохимическое и серологическое типирование.

10.2. При положительном результате биохимического и серологического типирования проба пищевого продукта считается положительной и расценивается как содержащая жизнеспособные бактерии рода Salmonella.

11. Способы отбора смывов

11.1. В ходе производственного и инспекционного контроля пищевых предприятий, вырабатывающих и реализующих пищевые продукты, широко используется метод смывов с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность оценить санитарно-эпидемиологическое состояние обследуемых объектов.

11.2. Отбор смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробки для пробирок, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливается (в асептических условиях) по 5 мл бульона предобогащения (забуференная пептонная среда) таким образом, чтобы тампон не касался жидкости.

11.3. Непосредственно перед отбором смыва с поверхности тампон опускают в жидкость.

11.4. При проведении отбора смывов необходимо использовать трафарет в соответствии с установленным порядком контроля объектов. После отбора смывов пробирки со средой обогащения вместе с тампоном необходимо поместить в термостат на 24 ч, инкубировать при 37 °С.

11.5. Далее исследование проводится в соответствии с п. п. 6.3 - 6.5.

12. Требования к помещениям и технике безопасности

Работа по определению бактерий рода Salmonella методом твердофазного иммуноферментного анализа должна осуществляться в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами», ГОСТ Р 51446 «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

13. Чувствительность метода

13.1. Чувствительность метода составляет: 1 КОЕ бактерий рода Salmonella на 25 г пробы пищевого продукта до инкубации в средах предобогащения (по данным инструкции производителя тест-системы). 5

13.2. Чувствительность метода перед детекцией в ИФА — от 100 до 10 — 6 10 жизнеспособных бактерий рода Salmonella в 1 мл культуральной жидкости.

---