Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации
(утв. Госкомсанэпиднадзором России 26.02.1996 № 01-19/16-17)
(с изм. от 08.06.2000)
Внимание
Документ утратил силу в части определения токсичности воды в связи с изданием МР 11-1/133-09, утв. Минздравом России 08.06.2000.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["Определение токсичности воды... (от 26.02.1996 N 01-19/16-17)"]:::doc click n0 "https://bukva.ai/docs/01-1916-17" "Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации (утв. Госкомсанэпиднадзором Росс" n1["МР 11-1/133-09"]:::rst click n1 "https://bukva.ai/docs/mr-11-1133-09" "МР 11-1/133-09. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста'Эколюм'. Методические рекомендации (утв. Минздравом России 08.06.2" n2["МР N 01.021-07"]:::doc click n2 "https://bukva.ai/docs/metodika-01-021-07" "МР N 01.021-07. Методика экспрессного определения интегральной химической токсичности питьевых, поверхностных, грунтовых, сточных и очищенных сточных вод с помощью бактериального т" n0 --> n1 n1 --> n2 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
Г. Г. Онищенко 26 февраля 1996 г. № 01-19/16-17
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ВОДЫ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ПО ИНТЕНСИВНОСТИ
1. Разработаны Научно-техническим центром «Аргумент» и биологическим факультетом МГУ.
1. Область применения
Методика предназначена для быстрого и количественного контроля степени интегральной токсичности проб воды и водных вытяжек различных объектов окружающей среды в лабораторных и полевых условиях с использованием в качестве тест-объекта препаратов лиофилизированных люминесцентных бактерий «Эколюм» и измерительного прибора серии «Биотокс».
Объектами исследования могут быть пробы природных вод, льда и осадков; вод хозяйственно-питьевого назначения; промышленных и сточных вод; почв; материалов и изделий.
Тест-система реагирует на токсические соединения разнообразной химической природы (например: металлы, фенолы, углеводороды, пестициды, микотоксины и многие другие с порогом определения порядка 0,01 мг/л), а также в смеси веществ позволяет определить эффект синергизма токсического действия.
2. Значение характеристики погрешности методики
Метрологические характеристики биотеста соответствуют аттестации 4/7-93, проведенной органами Госстандарта.
Воспроизводимость результатов определения тест-параметра — 5%.
3. Сущность методики
Метод определения токсичности основан на том, что тест-объект (люминесцентные, светящиеся бактерии) при действии поллютантов изменяет свои физиолого-биохимические функции, в том числе активность фермента бактериальной люциферазы, ответственного за интенсивность биолюминесценции, и реагирует на действие различных химических и биологических факторов аналогично высшим животным. Оценка токсичности основана на определении величины изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при действии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде, водорастворимых форм поллютантов, содержащихся в почве и материалах, по сравнению с контролем.
Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины — индекса токсичности Т, равного отношению:
где Io и I — соответственно интенсивности биолюминесценции контрольной и исследуемой пробы через определенный интервал времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.
В качестве критериев токсичности принимаются величины Т:
4. Средства измерения
Прибор-люминометр серии «Биотокс», производимый согласно ТУ-446-У-028-00-ОТУ с набором кювет объемом 1,5 мл для измерения биолюминесценции
Посуда мерная, лабораторная, стеклянная по ГОСТ 1770-74 и ГОСТ 20292-74
цилиндры мерные емкостью 10, 50 мл
Автоматические дозаторы на 20 — 1000 мкл
Весы лабораторные общего назначения 1 класса ГОСТ 24104-88 с пределом допустимой погрешности до 0,01 мг и 3 класса с пределом допустимой погрешности до 2 мг
Бумага индикаторная, универсальная для измерения рН.
5. Вспомогательные устройства и лабораторная посуда
Стеклянные стаканы на 100 мл, конические колбы на 50, 100 мл по ГОСТ 1770-74.
Вся посуда для отбора проб и биотестирования должна быть тщательно вымыта, сполоснута дистиллированной водой и высушена. Не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями.
6. Реактивы и материалы
Препарат лиофилизированных люминесцентных бактерий «Эколюм», производимый согласно ТУ-6-09-20-236-93
Раствор цинка сернокислого 7-водного в дистиллированной воде используется как модельный токсикант согласно метрологической аттестации 4/7-93, проведенной органами Госстандарта
Натрия гидроокись, х.ч. ГОСТ 4328-77
Натрий хлористый, х.ч. ГОСТ 4233-77
Соляная кислота, х.ч. ГОСТ 3118-77
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
7. Требования безопасности
На методику распространяются общие правила безопасности при работе с химическими реактивами общего применения ГОСТ 12.4.021 и электробезопасности при работе с приборами — ГОСТ 12.1.019.
8. Требования к квалификации оператора
Определение токсичности по методике выполняется оператором с квалификацией лаборанта со средним специальным образованием.
9. Отбор проб, подготовка к анализу
9.1. Отбор проб, их хранение и транспортировка осуществляется в соответствии с руководящими документами, действующими в системе Государственного санитарно-эпидемиологического и экологического контроля.
ГОСТ 17.1.5.05-85. ОПГ. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и осадков.
ГОСТ 17.1.5.94-81. ОПГ. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия.
НВН 33-5.3.01-85. Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод.
ИСО 5667/2. Качество воды. Отбор проб. Ч. 2. ГОСТ 2874-82. Вода питьевая.
ГОСТ 2481-80. Вода питьевая. Отбор проб.
ГОСТ 14.4.4.02-84. Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического анализа.
Инструкция по санитарно-химическому исследованию изделий. М., 1972, МЗ СССР.
ГОСТ 2761-84. Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические и технические требования и правила выбора. М., 1985.
9.2. Биотестирование проб воды и водных вытяжек проводят не позднее 6 ч после их отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (4 — 6 °С). Не допускается консервирование проб с помощью химических веществ.
9.3. Необходимый для выполнения анализа (в трех повторностях) объем водной пробы составляет не более 1,5 мл.
9.4. При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре тест-объекта. Температурный оптимум для биотеста составляет 15 — 25 °С.
9.5. Извлечение водорастворимых форм химических соединений из проб почвы.
Приготовляют навеску воздушно-сухой почвы (массой не менее 5,00 г с точностью 0,01 г), растирают в ступе и переносят ее в коническую колбу: мерным цилиндром отбирают пятикратный объем (5 мл/г образца почвы) дистиллированной воды (рН — 7,0 — 7,4), доливают в коническую колбу, несколько раз встряхивают и оставляют на экстракцию и отстаивание в течение 12 ч. Отфильтрованный экстракт в объеме 0,5 мл тестируют на токсичность. Предварительные результаты можно получить через 2 ч экстракции.
9.6. Извлечение водорастворимых форм химических соединений из материалов и изделий.
В сосуд помещают изделие, и заливают 5-кратным объемом (5 мл на 1 г образца) дистиллированной воды (рН — 7,0 — 7,4), и выдерживают в течение 12 ч. Полученный экстракт тестируют на токсичность в объеме 0,5 мл. Предварительные результаты можно получить через 2 ч экстракции.
9.7. При наличии в сточных водах крупнодисперсных включений необходима фильтрация пробы через фильтры обеззоленные, ТУ 6-09-1678-86.
9.8 Природные воды фильтруют через фильтр диаметром 0,45 — 0,5 мкм.
9.9. При анализе морской воды используют препараты «Эколюм» на основе морских люминесцентных бактерий. В случае использования в качестве тест-объекта морских люминесцентных бактерий в качестве маточного раствора используют 2%-ный раствор натрия хлористого на дистиллированной воде.
10. Проведение анализа
10.1. Подготовка к выполнению измерений
10.1.1. Приготовляют тест-систему путем вскрытия флаконов с лиофилизованными бактериями, добавлением 10 мл охлажденной до температуры 4 — 8 °С дистиллированной воды (рН — 7,0 — 7,4) и интенсивного встряхивания. Регидратацию лиофилизованных бактерий проводят в течение 30 мин. Затем полученную суспензию бактерий выдерживают не менее 30 мин. до достижения температуры 15 — 25 °С и разбавляют дистиллированной водой.
10.1.2. Подготовку прибора «Биотокс» проводят в соответствии с методикой поверки прибора и инструкцией по эксплуатации.
10.2. Выполнение измерений
Для биотестирования из колбы отбирают по 0,5 мл суспензии бактерий и добавляют в три опытных и три контрольных кюветы объемом по 1,5 мл. В три контрольных кюветы добавляют по 0,5 мл дистиллированной воды, в три опытных — по 0,5 мл исследуемого раствора.
Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе может быть произвольным, но равным в контроле и исследуемой пробе. Объемы контрольной и исследуемой пробы должны составлять по 1 мл.
Измерение интенсивности биолюминесценции проводят с помощью прибора «Биотокс» спустя 30 мин. попарно контроль-опыт. В экспрессном варианте допустимо время экспозиции биосенсора с пробой в течение 5 мин.
10.3 Работа с прибором «Биотокс»:
- вставить кювету с контролем в кюветный модуль, нажать кнопку «КОНТРОЛЬ», через 10 сек. на индикационном табло появляется усредненная величина интенсивности биолюминесценции тест-объекта (в относительных единицах);
- вставить кювету с опытным образцом в кюветный модуль, нажать кнопку «ПРОБА», через 10 сек. на индикационном табло появляется усредненная величина интенсивности биолюминесценции тест-объекта (в относительных единицах);
- нажать кнопку «ТОКСИЧНОСТЬ» — на индикационном табло появляется значение индекса токсичности (в относительных единицах);
- нажать кнопку «СБРОС» для обнуления памяти прибора;
- повторить операции определенное количество раз для пар контроль-опыт (для одного измеряемого образца), записать в протокол результаты определения токсичности;
- при использовании одного контрольного образца для серии различных проб измерение контроля проводится один раз и прибор соотносит автоматически показания проб и контроля с индикацией индекса токсичности для каждой пробы.
11. Вычисление результатов измерений
11.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию и интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности Т (прибор «Биотокс» позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора «Биотокс».
11.2 Индекс токсичности Т есть величина безразмерная и определяется по формуле:
где Io и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте через определенное время экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.
Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины токсичности Т по формуле:
Т = (Т + Т + Т ) / 3. ср 1 2 3 Величины Т , Т и Т получают из трех параллельных измерений 1 2 3
контроль-опыт в короткий промежуток времени.
11.3. В случае определения токсичности пробы (Т равно и больше 20) можно определить, насколько это связано со значениями рН исследуемого раствора. Для этого измеряют рН пробы, и если величина рН находится за пределами 6,5 — 8,0, приводят рН до значений 7,0 — 7,4 и повторяют измерение токсичности.
11.4. В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле — индекс Т принимает отрицательные значения. При Т меньше 10, проба содержит токсические соединения.
При Т, равном от -10 до +5, для всех проб для более достоверного вывода о «нетоксичности» образца, следует провести дополнительные измерения с кратным (в два раза) разбавлением анализируемой пробы. В случае, когда индекс Т не будет выходить за рамки от -10 до +5 — проба «не токсична».
11.5. По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на четыре группы.
| Группы | Величина Т | Вывод о степени токсичности |
|---|---|---|
| 1 | от -10 до 20 | допустимая степень токсичности |
| 2 | от 20 до 49 | образец токсичен |
| 3 | равно или больше 50 | образец сильно токсичен |
| 4 | меньше -10 | образец не токсичен |
11.6 Результаты измерений оформляют протоколом.
ПРОТОКОЛ № 275 определения токсичности с биосенсором «Эколюм»
__________________ сточные воды предприятия __________________
название пробы
Дата проведения биотестирования 13 апреля 1995 г.
Время экспозиции _________________ 30 мин. ___________________
______________________________________________________________
контроль опыт | | 1 | 2 | 3 | среднее | 1 | 2 | 3 | среднее |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Интенсивность биолюминесценции | 4357 | 4262 | 4387 | 4338 | 1321 | 1532 | 1368 | 1407 | | Индекс токсичности | | | | | 69,6 | 64,0 | 69,5 | 67,5 |
Оценка токсичности пробы __________ 67,5 __________ (усредненный индекс токсичности)
Вывод анализа __________ высокая степень токсичности _____________
Оператор __________ __________ Иванова И.И. _____________
(подпись) (Ф.И.О.)
12. Контроль погрешности результатов измерений
Оперативный контроль погрешности проводится в соответствии с аттестацией 4/7-93, проведенной органами Госстандарта путем действия раствора, содержащего 1 мкг цинка сернокислого 7-водного в 1 куб. см дистиллированной воды (модельный токсикант), при времени инкубации 15 мин., вызывающего уменьшение интенсивности свечения биолюминесценции биосенсора «Эколюм» более чем в 2 раза по сравнению с контролем. В случае если это отношение меньше двух, биосенсор «Эколюм» не используется.
Для доказательства правильности вывода о степени токсичности образца каждое определение необходимо проводить в трех повторностях.