2.1.7. Почва, очистка населенных мест, бытовые и промышленные отходы, санитарная охрана почв. Микробиологические критерии в гигиенической оценке почв при загрязнении бытовыми и промышленными отходами. Методические рекомендации

(утв. Госкомсанэпиднадзором России 26.02.1996 № 01-19/15-17)

2.1.7 ПОЧВА, ОЧИСТКА НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ, БЫТОВЫЕ

1. Разработаны Управлением комплексных программ Госкомсанэпиднадзора России, Северо-западным научным центром гигиены и общественного здоровья, Институтом проблем промышленной экологии Севера КНЦ РАН, Московским НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Исполнители: В.П. Чащин, Г.Л. Анфалова, Г.М. Трухина, Л.Д. Грачева, Т.Я. Пожидаева, Г.В. Калабин, Г.А. Евдокимова, Н.П. Мозгова, В.И. Кушнер.

Введение

Негативное воздействие на природу в России приобрело глобальный характер. Площадь почвенного покрова, загрязненного тяжелыми металлами и фторидами, составляет 3,6 млн. га. Локальная нагрузка в некоторых местах достигает 10 т на квадратный километр (при среднем максимальном значении 0,2 т), площадь почвенного покрова с высокой степенью загрязнения составляет 253 тыс. га.

Помимо прямого воздействия загрязнителей на человека, многие из них влияют на человека и опосредованно через системы «почва — растение», «почва — атмосферный воздух», «почва — грунтовые воды», «почва — микроорганизмы, биологическая активность».

Показатели санитарного состояния почв, загрязняемых хозяйственно-бытовыми и сельскохозяйственными отходами, хорошо разработаны. К ним относятся такие критерии, как численность сапрофитных бактерий, соотношение спорообразующих и неспорообразующих форм, коли-титр, наличие в почве энтерококков и клостридиев, т.е. индекс микроорганизмов, не свойственных почве и являющихся ее бактериальными загрязнителями.

Методическая основа контроля за санитарным состоянием почв при бактериологическом загрязнении и загрязнении органическими химическими веществами, вносимыми в почву в технологических целях (пестициды, гербициды и т.п.), изложена в методических указаниях № 1446-76 «Методические указания по санитарному микробиологическому исследованию почвы» и в являющихся их дополнением методических указаниях № 2293-81 «Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы».

В гораздо меньшей степени разработаны показатели, характеризующие загрязнение почвы токсикантами промышленного происхождения, попадающими в почву через атмосферные выпадения или вносится непосредственно в виде промышленных отходов, особенно это касается тяжелых металлов, являющихся основными загрязнителями в северных районах страны.

Особый интерес при исследовании различных аспектов экологических последействий антропогенных загрязнителей представляет биологическая активность почвы или состояние ее «здоровья». Поэтому при определении токсичности этих соединений на почвенную биоту целесообразно проводить микробиологическое тестирование.

Микроорганизмы, принимая активное участие в самоочищении геосистем, сами подвергаются вредному воздействию загрязнителей. В результате такого воздействия могут существенно измениться свойства биоты, снижается ее самоочищающий потенциал.

Действие тяжелых металлов и кислых осадков на почвенные микроорганизмы во многом сходно с действием этих загрязнителей на растения и животный мир. Поэтому нужны такие индикаторы, которые указывали бы на намечающиеся нежелательные изменения в почве еще до того, как они достигнут угрожающих для здоровья человека размеров.

Рекомендации предназначены для врачей и специалистов государственной санитарно-эпидемиологической службы.

1. Общие положения

1.1. Для выявления малых концентраций загрязнителей чаще всего используются химические методы анализа, так как в силу своей высокой адаптационной способности микроорганизмы не могут быть индикаторами на самых ранних стадиях загрязнения. Однако только ответная реакция живых организмов на уровне сообщества дает целостную картину состояния экосистемы. При этом отклик микробного сообщества может проявиться на различных уровнях организации (ценотическом, популяционном, организменном) и выразиться в изменении численности, разнообразии и соотношении эколого-трофических групп.

Вредное влияние загрязнений на отдельные сообщества микробов приводит к перераспределению их состава — в почве устанавливается не свойственное ей соотношение группировок.

1.2. Наблюдения необходимо начинать с учета численности микроорганизмов и накопленной ими биомассы. Эти показатели важны как для непосредственной характеристики микробного ценоза и определения степени участия микроорганизмов в общей продукции живой материи в геосистеме, так и для определения реакции микробного сообщества на воздействие различных факторов.

1.3. Для оценки опасности загрязнения почв химическими веществами выбор микробиологических показателей проводится с учетом:

• высокой чувствительности к токсиканту (так как ранняя диагностика возможна, если реакция на воздействие заметна при очень низких концентрациях и после короткого периода действия), т.е. с учетом наличия в сообществе микроорганизмов-индикаторов, по наличию, состоянию и (или) поведению которых можно судить о характере изменений свойств ОПС;
• трансформирующей способности микроорганизмов;
• естественного микробного фона;
• климатогеографических особенностей региона.

1.4. Эколого-микробиологическая концепция охраны почв от химического загрязнения базируется на индикаторной роли микроорганизмов для определения качества среды обитания, регуляторной функции микроорганизмов в деградации, трансформации и ассимиляции загрязняющих веществ, в результате чего эти вещества распадаются до нетоксичных минеральных соединений.

1.5. Биодинамические исследования рекомендуется осуществлять для установления критериев повреждения экосистем.

Основное требование, необходимое при изучении динамики численности и биомассы почвенных микроорганизмов, — точность и достоверность получаемых данных, а они, в свою очередь, зависят от того, какие компоненты комплекса почвенных микроорганизмов учитываются и какими методами осуществляется подобный учет.

1.6. В качестве микробиологических критериев вредного влияния промышленных и хозяйственно-бытовых загрязнений на почвы рекомендуется принимать следующие показатели:

• структура и качественный состав микробного компонента;
• азотфиксирующая активность почвы;
• синтез внеклеточных (свободных) аминокислот.

Диапазоны изменения показателей, характеризующих различные состояния почвенной экосистемы по состоянию микробных сообществ (на примере окультуренных почв), приведены в таблице 1.

Показатель	Уровни состояния системы
	естественное	нарушенное	катастрофическое
1. Микробный (бактериальный) пул, млрд. кл./1 г почвы
- минимальный	0,55	0,50	0,41
- максимальный	4,0 — 6,0	4,0	1,40
2. Азотфиксирующая активность, этилен, мкмоль/г/сут.	2,0 — 2,7	0,2 — 1,0	0
3. Синтез свободных аминокислот, мг/1 г ткани	6 — 8	3 — 6	0 — 3

2. Гигиеническая оценка почвы по микробиологическим показателям

Отбор, подготовку и обработку почвы для анализа проводить согласно Методическим указаниям № 1446-76.

2.1. Определение общей численности почвенной микрофлоры (общесанитарный показатель вредности)

Это определение осуществляется люминесцентно-микроскопическим методом с окраской акридин оранжевым.

Навеску почвы в 1,0 г растирают с 10 мл 1%-ного раствора пирофосфата натрия для снижения адсорбционных свойств почвы и десорбции микроорганизмов. 1 мл полученной суспензии обрабатывают 1 — 2 каплями 1%-ного раствора акридина оранжевого. Через 5 сек. в обработанную красителем почвенную суспензию помещают 2,0 — 2,5-сантиметровый отрезок счетного капилляра. Заполненный капилляр помещают на предметное стекло и фиксируют 2 каплями расплавленного парафина, нанося его на концы капилляра (парафин одновременно с фиксацией защищает содержимое капилляра от высыхания). Подсчет общей численности почвенных микроорганизмов проводят с помощью люминесцентного микроскопа при увеличении 90:10.

Численность микроорганизмов в 1 г почвы определяют по формуле:

Q = \frac{N \times 10^{12}}{u} \times C,

где: Q — количество микроорганизмов в 1 г изучаемого образца почвы;

u — объем одного хода капилляра в кубических микронах; С — кратность разведения суспензии (обычно она равна 10).

2.2. Определение азотфиксирующей активности почвы ацетиленовым методом

Метод основан на способности нитрогеназы (азотфиксирующего ферментного комплекса микроорганизмов) восстанавливать ацетилен до этилена в количестве, пропорциональном количеству азота, которое может быть зафиксировано в данных условиях. Количество образовавшегося этилена соотносится с соответствующим ему количеством азота, как 3:1. Потенциальную азотфиксирующую активность выражают количеством образовавшегося этилена в микромолях на 1 г почвы в сутки (мкмоль/г/сут.).

Проведение анализа: почвенную пробу в суховоздушном состоянии просеять через сито с диаметром пор 1 мм и взять навеску — 1 г торфяной или 5 г минеральной почвы в пенициллиновые склянки. Пробы почвы увлажнить до 60% полной влагоемкости и инкубировать образцы под ватными пробками в течение суток при температуре 27 °C. Затем в почву добавить 1% глюкозы и инкубировать образцы под ватными пробками в течение суток, первоначально без ацетилена для достижения максимального уровня размножения микроорганизмов, а затем столько же времени с ацетиленом под герметичными пробками (резиновые пробки с металлической окантовкой).

Определение выделившейся углекислоты и образовавшегося этилена проводится газохроматографическим методом. Повторность опытов пятикратная.

Примечание: За нижнюю пороговую концентрацию принимают минимальную концентрацию экзогенного химического вещества, достоверно снижающую активность азотфиксации и синтеза внеклеточных аминокислот на 25%.

2.3. Аппликационный метод определения аминокислот в почве

Метод основан на определении внеклеточных аминокислот (нингидринположительных веществ), накопившихся на хлопчатобумажной ткани, экспонированной в почве.

Используемые реактивы:

1. Раствор нингидрина: 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне готовится из чистого нингидрина, перекристаллизованного из 2N соляной кислоты.

2. Уксусная кислота ледяная.

3. Реактивный раствор: 95 частей 0,5%-ного раствора нингидрина в ацетоне смешать с 1 частью ледяной уксусной кислоты и 4 частями дистиллированной воды.

4. Спиртовой раствор сульфата меди: 0,005 г безводного сульфата меди растворить в 22 мл дистиллированной воды и довести объем до 100 мл 96%-ным этиловым спиртом.

5. Раствор лейцина: 10 мг лейцина растворить в 10 мл 10%-ного изопропилового спирта.

Подготовка полотен к закладке в почву. Все операции по подготовке полотен, закладке их в почву и дальнейшей обработке выполняются в резиновых перчатках. Некрашеное хлопчатобумажное или льняное полотно (батист, бязь) размером 10 x 20 см кипятится в дистиллированной воде в течение 15 мин., высушивается, нумеруется простым карандашом, пришивается по краям к плотной, протертой спиртом полиэтиленовой пленке того же размера, закладывается вертикально на выровненную стенку почвенного разреза и плотно прижимается к почве (после чего разрез тщательно маскируется).

Экспозиция полотен в почве проводится в течение 2 — 3 недель в зависимости от типа почвы и ее влажности.

Обработка полотен и определение аминокислот. Аккуратно извлеченные из почвы полотна просушиваются, тщательно очищаются от почвы встряхиванием и кисточкой. Очищенные полотна обрабатываются 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне погружением их в раствор на 1 — 2 сек. и высушиваются при комнатной температуре или в сушильном шкафу в течение 30 мин. Окрашенная ткань разрезается на квадраты 5 x 5 см (при этом получается по 2 повторности из каждой глубины). Взвешенные на аналитических весах и измельченные ножницами квадратики ткани помещаются в пробирки с 10 мл 0,005%-ного раствора сульфата меди на 75%-ном этиловом спирте. Пробирки с тканью, периодически встряхиваемые, выдерживаются в темном месте при комнатной температуре до полного обесцвечивания ткани. Полученная вытяжка колориметрируется относительно контрольной пробы на фотоколориметре при длине волны 450 нм (зеленый светофильтр) в кювете с 1 до 10 мм.

Количество аминокислот рассчитывается по калибровочной кривой, построенной по лейцину.

Построение калибровочной кривой.

В три серии пробирок с 0,05; 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60; 0,70; 0,80; 0,90 и 1,00 мл раствора лейцина вводится по 2 мл раствора нингидрина и общий объем доводится до 10 мл дистиллированной водой. По найденным значениям оптической плотности полученных растворов и их концентрациям строится калибровочный график в координатах: X — концентрация лейцина, Y — оптическая плотность.

3. Оценка состояния почвы экспресс-методами

Методики биотестирования, признанные стандартными, требуют для проведения экологических исследований чаще всего значительных временных затрат (от 24 до 96 часов и более).

3.1. Определение степени токсичности с помощью «Биотестера-2»

Методики экспресс-анализа позволяют сократить время экспериментов до десятков минут. Важным критерием, определяющим экспрессность данных методик, является их обеспеченность аппаратурными средствами измерений. Наиболее часто в аппаратурных разработках реализуется исследование параметров реакций поведенческого типа, в частности, уход тест-организмов из зоны воздействия (хемотаксис). Подобная реакция исследуется с помощью прибора «Биотестер-2», серийно выпускаемого фирмой «Квант» (С.-Петербург) и позволяющего достаточно быстро оценивать степень острой токсической загрязненности анализируемых проб (природных водоемов и сточных вод).

Определение степени токсичности проб проводить в соответствии с инструкцией к прибору «Биотестер-2».

3.2. Безаппаратурные экспресс-методы

В качестве дополнительных методов могут применяться экспрессные безаппаратурные методики определения состояния почвы, в том числе:

---