Методические рекомендации № 01.037-08. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки моющих средств с помощью люминесцентного бактериального теста
Актуально на 09.11.2026.
Как цитировать: "Методические рекомендации N 01.037-08. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки моющих средств с помощью люминесцентного бактериального теста". 01.037-08. https://bukva.ai/docs/01-037-08
(утв. Роспотребнадзором 20.11.2008)
Утверждаю Главный врач ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Председатель Лабораторного Совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А. И. Верещагин 20 ноября 2008 года
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ МОЮЩИХ СРЕДСТВ С ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ТЕСТА
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ № 01.037-08
Методические рекомендации разработаны ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве», МГУ им. М.В. Ломоносова.
Методические рекомендации содержат описание метода тестирования моющих средств с применением в качестве тест-объекта реактива люминесцентных бактерий «Эколюм» и определяют порядок проведения испытаний следующих видов моющих средств.
Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой продукции с учетом общетоксического и раздражающего действия.
Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.
Методические рекомендации предназначены для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ, учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов моющих средств и контроль их качества.
Результаты исследования качества моющих средств учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного влияния на здоровье человека.
1. Закон РФ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 19 апреля 1991 г.
2. «Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. № 625
3. Руководство Р 1.1.001-96 «Общие требования к организации разработки нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования»
4. Руководство Р 1.1.003-96 «Общие требования к построению, изложению и оформлению нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования»
5. ГОСТ Р 1.5-92 «Государственная система стандартизации Российской Федерации. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов»
6. МУ 2196 «Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны»
7. МР 11-1/131-09 «Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста»
8. МУ 2102 «Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи»
9. МУ 1109 «Временные методические указания по гигиенической оценке и санитарному контролю за применением, хранением и продажей населению предметов бытовой химии»
Экотоксикологический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в водные объекты.
Химическое загрязнение воды — изменение химического состава воды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для здоровья населения.
Токсичность — степень проявления ядовитого действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность — один из важных факторов, определяющих качество воды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности воды при ее использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе воды.
Критерий токсичности (индекс токсичности) — достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности воды. Среди тест-параметров наиболее часто используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция — это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование — проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемой воде, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция — интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
В качестве тест-объекта используются препараты «Эколюм» лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
Критерием токсического действия является изменение с помощью прибора «Биотокс-10» интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по сравнению с раствором, не содержащей токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
При изучении токсикологических свойств бытовой химической продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высшие животные, культуры клеток человека и другими биотестами.
5. Количественная оценка параметров тест-реакции
Токсическое действие исследуемой пробы на биосенсор определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте — 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины — индекса токсичности «Т» и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.
Индекс токсичности «Т», равный отношению
где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериями.
Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:
-
допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности Т меньше 20;
-
образец сильно токсичен: индекс токсичности Т равен или более 50.
Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения Iо и I, позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).
ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой:
где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция G очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец высоко токсичен. График G-функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр «Биотокс-10» позволяет представлять величины G для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.
Количественным параметром токсичности моющих средств является степень разбавления образца по отношению к исходному продукту, приводящая к величине параметров ЕС20 (токсичности) и ЕС50 (острой токсичности). Количественным параметром оценки качества моющих средств по сравнению с эталоном этой продукции и оценки ингредиентов моющих средств служит индекс токсичности.
6. Оборудование, химическая посуда и реактивы
Измерительный прибор — люминометр типа «Биотокс-10» с набором кювет на 1,5 мл.
Лиофилизированная культура микроорганизмов «Эколюм» или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.
Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг, ГОСТ 24104-88.
pH-метр, ГОСТ 25.7416.071, или аналоги.
Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4 °С.
Пробирки с притертыми пробками объемом 3 — 5 мл, ГОСТ 1770-74.
Дозаторы пипеточные на объемы 1,0 — 0,1 мл.
Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.
Воронки делительные на 100 мл, типа ВД-1-100.
Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80, или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.
Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.
Спирт этиловый, х.ч., ТУ 6-091710.
7. Характеристика тест-объекта «Эколюм» и прибора «Биотокс-10»
Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01 Биосенсор, содержащийся при температуре от -4 до -18 °С, имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.
Специализированный люминометр «Биотокс-10» является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии «Эколюм». Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.
Портативный прибор «Биотокс-10» может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса токсичности, вычисление стандартного отклонения показателя токсичности, определения величин ЕС20 и ЕС50 — пороговых значений допустимой степени и острой степени токсичности образца, исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерная обработка данных, наличие сигнала для оператора при превышении пробой допустимого уровня токсичности.
8. Условия безопасного проведения работ
При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.
Хранить тест-культуру «Эколюм» в холодильнике при температуре от -18 °С до +4 °С, следует беречь культуру лиофилизированных бактерий от нагревания и резкой смены температуры.
9. Требования к квалификации лиц, проводящих биотестирование
Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант, имеющий опыт работы в области токсикологии.
10. Условия выполнения измерений
Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.
Температура окружающего воздуха в лаборатории от +18 до 25 °С. Относительная влажность воздуха 80 +/- 5%. Атмосферное давление 84 — 106 кПа (630 — 800 мм рт. ст.). При использовании электроприборов частота переменного тока 50 +/- 1 Гц. Напряжение сети 220 +/- 10 В.
Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.
11. Подготовка к проведению измерений
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемый образец.
11.1 Подготовка посуды для отбора,
хранения проб и биотестирования
Обычно используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2 — 3 час. посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3 — 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, — в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.
11.2 Подготовка проб
Извлечение водорастворимых форм химических соединений из моющих средств. Экстракты из образцов готовят путем настаивания в дистиллированной воде. В сосуд помещают 1 мл жидкого образца (или 1 г порошкового образца) и заливают 10 мл дистиллированной воды (комнатная температура, pH 7,0 — 7,4) и выдерживают 10 мин. Рекомендуется периодическое встряхивание раствора. Затем отбирают 0,1 мл раствора в сосуд и добавляют 10 мл дистиллированной воды. Выдерживают 10 мин. Таким образом, получают «первичное» (1000-кратное) разбавление исходного образца.
Далее проводят дополнительное разведение экстракта дистиллированной водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт:вода 1:1 (первичное разведение); 1:2; 1:4 и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.
Например, отбирают в пробирку с пробкой 5 мл образца первичного разведения (разведение 1:1), добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:2. Затем в другую пробирку отбирают 5 мл этого экстракта и добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:4. Потом в другую пробирку отбирают 5 мл этого экстракта и добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:8.
При исследовании отдельных ингредиентов моющих средств необходимо сделать 4 последовательных разведения дистиллированной водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт:вода 1:1; 1:2; 1:4 и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.
Для улучшения достоверности данных и уменьшения экспериментальных ошибок, связанных, например, с взвешиванием, измерением объемов или разбавлением рекомендуется увеличить число серий независимых разбавлений до трех, а при плохой сходимости данных серий увеличить их число.
Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.
11.3 Подготовка тест-объекта «Эколюм»
и прибора «Биотокс-10»
Подготовка прибора «Биотокс-10».
Подготовку прибора «Биотокс-10» проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Регидратация биосенсора «Эколюм».
Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом «Эколюм». Добавить 10 мл дистиллированной воды, pH 7,0 — 7,4, комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Желательно использовать стерилизованную дистиллированную воду. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.
Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.
Выдержать суспензию в течение 30 минут.
Определение рабочей концентрации биосенсора «Эколюм».
Измерить фоновое значение прибора «Биотокс-10» (по инструкции к прибору, при счете 10 сек. без кюветы) и записать это значение.
Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 — 7,4, комнатная температура).
Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Записать эту величину.
Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 25 — 250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.
Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.
В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 — 7,4). При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы моющих средств различного разведения.
Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора «Биотокс-10» в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.
12.1 Определение токсичности образцов моющих средств
При исследовании моющих средств после вывода прибора в режим измерения ЕС определяется интенсивность свечения контрольной кюветы и 4-х проб, полученных путем разбавления исследуемой пробы дистиллированной водой в следующих отношениях 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4-х проб автоматически определяется G-функция, значения которой заносятся в оперативную память микроконтроллера прибора. По данным этих измерений микроконтроллер при нажатии специальной кнопки клавиатуры управления производит автоматически вычисление коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее.
При исследовании коэффициентов ЕС ингредиентов моющих средств рекомендуется убедиться при измерении токсичности приготовленного раствора, что величина G для данной пробы не превышает значения 25. В случае, если величина больше, может увеличиться погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу дистиллированной водой.
Как при исследовании моющих средств, так и их ингредиентов, после определения путем измерения величины ЕС20 — насколько надо разбавить раствор, чтобы он стал нетоксичным, необходимо учесть вклад этапа предварительного разбавления.
Следует обратить внимание, что при интенсивности биолюминесценции опыта больше или равным контроля вычисление G-функции не производится. В этом диапазоне образец не токсичен. Следует уменьшить степень первичного разбавления.
Для большей достоверности проведения измерений рекомендуется делать несколько параллельных разбавлений исходного образца.
12.2 Определение соответствия качества моющих средств
по сравнению с эталонным образцом
В случае наличия эталонного образца моющего средства исследования качества продукции проводятся по сравнению опытного и эталонного образцов. Водная экстракция из эталонного образца проводится, как указано выше, и этот раствор используется как контроль. Условия экстракции должны быть строго одинаковыми в контроле и опыте.
Измеряется свечение эталонной пробы и прибор запоминает эту величину. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы и усредненную величину индекса токсичности. В этом анализе параметры ЕС не измеряются.
Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «Т». Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора «Биотокс-10».
Приготовляют три повторности водного экстракта ингредиента. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности «Т» по формуле:
где Т1 — Т3 — повторности опытной пробы.
Величины Т1, Т2 и Т3 получают при измерении в последовательности контроль, и затем серии опытных образцов.
Прибор «Биотокс-10» автоматически определяет усредненный показатель индекса токсичности и погрешность измерения. Если погрешность измерения большая, необходимо увеличить число повторностей.
В случае определения токсичности пробы при малых разведениях можно определить насколько это связано со значениями pH исследуемого раствора. Для этого измеряют pH пробы и, если величина pH находится за пределами 6,5 — 8,0, приводят pH до значений 7,0 — 7,4 и повторяют измерение токсичности.
В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
13. Обработка, оценка и оформление результатов
Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «Т» и параметров ЕС20 и ЕС50.
В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
По величине индекса токсичности анализируемой пробы классифицируются на три группы (таблица 1).
| Группы | Величина индекса токсичности «Т» | Вывод о степени токсичности |
|---|---|---|
| 1 | меньше 20 | допустимая степень токсичности |
| 2 | от 20 до 50 | образец токсичен |
| 3 | равно или больше 50 | образец сильно токсичен |
Количественные оценки токсичности образцов моющих средств (параметр ЕС20) и их ингредиентов (индекс токсичности) представлены в таблице 2.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ПАРАМЕТРЫ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ПК ПРОДУКЦИИ
| Вид продукции | Т | ЕС20 |
|---|---|---|
| Моющие средства | 1:5000 | |
| Ингредиенты моющих средств | 20 | концентрация, вызывающая ЕС20 |
| Сравнение моющих средств и их ингредиентов с эталонным образцом | 20 |
ПК продукция признается токсичной, если согласно параметру ЕС20 необходимо большее разбавление, нежели указано в таблице 2. При достижении параметра ЕС50 продукция признается сильно токсичной.
При определении токсичности ингредиента продукции нужно сопоставить концентрацию, вызывающую ЕС20, с концентрацией этого ингредиента в изделии. Если она больше, то необходимы дополнительные анализы с применением других методов для заключения о возможности использования ингредиента.
При обнаружении отличия моющих средств и ингредиентов от эталонных образцов на величину большую Т = 20 следует провести дополнительные исследования качества продукции другими методами.
Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1).
14. Контроль погрешности методики токсикологического анализа
Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному «эталонному» токсиканту цинку сернокислому 7-водному (ZnSC4 х 7H2O). Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 минут интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50%, составляет 0,6 — 1,5 мг/л.
Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.
Процедура определения диапазона реагирования тест-системы «Эколюм» на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 минут с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50%-ное ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если все правильно, то биосенсор не используется.
15. Форма представления результатов анализа
Результат токсикологического анализа в документах — индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:
\overline{X} \pm s,\text{при Р} = 0,95
где \overline{X} — среднее арифметическое определений.
За результат анализа (\overline{X}) принимают среднее арифметическое результатов трех (или более — до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности Т вычисляется по формуле:
Т = 100 (Iконтр. — Iопыт.) / Iконтр.,
где Iконтр. и Iопыт. соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.
Среднее квадратичное отклонение (\sigma) результатов определений количественного выражения тест-реакции — индекса токсичности вычисляется по формуле:
\sigma = \sqrt{\frac{\sum_{i = 1}^{n} (\overline{X} - X_{i})^{2}}{n - 1}} ,
Xi — i-й результат определений;
n — число параллельных определений.
Среднее арифметическое \overline{X} результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:
\overline{X} = \frac{1}{n} \sum_{i = 1}^{n} X_{i}.
Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором «Биотокс-10» автоматически по команде оператора.
ФОРМА РЕГИСТРАЦИИ УСЛОВИЙ И РЕЗУЛЬТАТОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ МОЮЩИХ СРЕДСТВ И ИХ ИНГРЕДИЕНТОВ
ПРОТОКОЛ N ____ определения токсичности пробы с помощью биотеста «Эколюм» и прибора «Биотокс-10»
Наименование организации __________________________________________________
Наименование пробы ________________________________________________________
Дата, время приготовления пробы ___________________________________________
Дата, время измерения _____________________________________________________
Объем (навеска) образца ___________________________________________________
Первичное разведение __________________________________________________ (А)
Величина ЕС20 (1-я серия разведений) ______________________________________
Величина ЕС20 (2-я серия разведений) ______________________________________
Величина ЕС20 (3-я серия разведений) ______________________________________
Средняя величина ЕС20 _____________________________________________________
Вычисленный объем пробы, приводящий к величине ЕС20 _______________________
Вывод о токсичности образца _______________________________________________
Анализ провел ____________________
ФОРМА РЕГИСТРАЦИИ УСЛОВИЙ И РЕЗУЛЬТАТОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ МОЮЩИХ СРЕДСТВ И ИХ ИНГРЕДИЕНТОВ ПО СРАВНЕНИЮ С ЭТАЛОНОМ
ПРОТОКОЛ N ____ определения токсичности пробы с помощью биотеста «Эколюм»